[发明专利]甲型流感病毒减毒株及其作为骨架病毒和疫苗的应用

说明书

本发明涉及人畜共患传染病学领域，具体而言，涉及一种甲型流感病毒减毒株及其作为骨架病毒和疫苗的应用。该病毒基因组被引入如下基因区域突变而被减毒：PB2的127‑2217位碱基片段；NP的106‑1422位碱基片段；NS的166‑495位碱基片段。采用去病毒化策略重编码病毒基因组能够降低流感病毒的致病力；并且重组流感病毒依然具有良好的免疫原性，其制备得到的疫苗可对同源和异源攻毒能够提供完全保护力。此外，该病毒株经过验证可以作为骨架基因的供体，与其他病毒株进行重组，以获得流感病毒疫苗候选株。

技术领域

本发明涉及人畜共患传染病学领域，具体而言，涉及一种甲型流感病毒减毒株及其作为骨架病毒和疫苗的应用。

背景技术

甲型流感病毒(英语：Influenza A virus，常简称甲流)是一种流感病毒，包含多种亚型，可感染野生鸟类、驯养家禽，以及猪、马和人等多种哺乳类动物并导致流行性感冒。该病毒是正黏液病毒科、甲型流感病毒属下的唯一一个物种。在全世界，流感病毒不仅每年发生季节性流行，而且间或暴发大流行。在过去的几十年里，各国家主要选择利用全病毒灭活疫苗和减毒活疫苗预防流感感染，它们主要刺激机体产生体液免疫抵抗相同亚型的血凝素表面糖蛋白。

目前较为常用的流感病毒减毒活疫苗为MedImmue公司上市的FluMist疫苗。该疫苗的亲本供体株为冷适应(ca)A/AnnArbor/6/60毒株，是由患者体内分离出来的野毒株在逐步低温条件下传代获得的。冷适应毒株在33℃条件下可以高效复制，但是在37℃条件下复制能力显著减弱，因此仅能够在人类的鼻腔中复制，而无法在下呼吸道复制，从而达到减毒的效果。采用“6+2”模式将冷适应亲本株的6个内部骨架基因(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)与流行株的两个表面蛋白基因(HA和NA)重组，即可以获得具有减毒特性的流感病毒疫苗株。冷适应亲本株的由PB1、PB2、NP这三个基因片段上的5个突变氨基酸位点协同作用产生。由于突变位点较少，因此存在回复突变导致病毒毒力返强的风险。并且2016-2017流感季冷适应减毒活疫苗的有效性显著降低，因此新的减毒活疫苗亲本株的研制十分急迫。

采用基因组密码子或密码子对重编码的方法制备的流感病毒减毒活疫苗表现出了令人振奋的结果，并且用该策略制备减毒活疫苗亲本株也具有一定的减毒效果。有研究对季节性人流感病毒基因组6个内部基因节段进行禽流感病毒化改造，共引入280个突变。将该亲本株内部基因与PR8病毒或HK68病毒表面基因重组得到的重组病毒株在体内和体外均表现出一定的毒力减弱。但是目前没有直接采用流感病毒使用率低的密码子对流感病毒基因组内部基因进行改造的研究，并且流感病毒内部基因所是否能够容纳更多的突变，这些突变是否会发生回复突变也并不清楚。

发明内容

本发明采用基因组密码子去流感病毒化重编码策略，向流感病毒PB2、NP、NS基因中共引入924个沉默突变，其他基因(例如PB1、PA、M、HA和NA中的一种或其组合)采用野生型病毒基因，得到了一株体内外复制能力、体内致病力均明显减弱的新型流感病毒减毒活疫苗亲本株(以下可简称RP)。RP作为减毒活疫苗单次免疫小鼠后能够诱导足够的免疫应答、免疫保护。不仅如此，该减毒活疫苗对异源病毒攻毒也能够提供完全保护。并且，RP可以与H1N1以及H3N2流感病毒表面基因重组，表现出作为亲本株的良好潜力。

具体地，本发明涉及一种甲型流感病毒减毒株，该病毒基因组被引入如下基因区域突变而被减毒：

PB2的127-2217位碱基片段替换为SEQ ID NO:1；

NP的106-1422位碱基片段替换为SEQ ID NO:2；

NS的166-495位碱基片段替换为SEQ ID NO:3。

采用去病毒化策略重编码病毒基因组能够降低流感病毒的致病力；并且重组流感病毒依然具有良好的免疫原性，其制备得到的疫苗可对同源和异源攻毒能够提供完全保护力。此外，该病毒株经过验证可以作为骨架基因的供体，与其他病毒株进行重组，以获得流感病毒疫苗候选株。