[发明专利]A型塞内卡病毒的微滴数字PCR检测引物、探针及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，具体公开了A型塞内卡病毒的微滴数字PCR检测引物、探针及其应用。本发明的A型塞内卡病毒的微滴数字PCR检测引物的核苷酸序列为：上游引物F：5’‑TGCACCCCTTCGCTGACTACGGT‑3’；下游引物R：5’‑GAGTTCTCCCAGAATCGCCG‑3’。探针的核苷酸序列为：探针P：5’‑GCCTTGTTCGACTGACCTGG‑3’。采用本发明的引物和探针进行A型塞内卡病毒微滴数字PCR检测特异性好、灵敏度高、重复性好，可直接定量，检测方便快捷、结果准确可靠。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种A型塞内卡病毒的微滴数字PCR检测引物、探针及其应用。

背景技术

猪塞内卡病毒病是由A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)引起的一种猪的传染性疾病，可引起仔猪、育肥猪、经产母猪和公猪鼻、唇部、蹄部、腹部、背部等部位出现水泡、脓包、溃疡等，并伴有跛行、站立困难，病猪死亡率可达30％-70％，并且引起发病猪生产性能大幅下降。目前，其表现的临床症状、危害程度等呈现愈来愈严重的趋势，已给养猪业带来了较大的经济损失，因此在临床上需要一种能够快速诊断SVA的检测方法。

传统的SVA检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、间接免疫荧光试验(IFA)和间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)等。目前最常用核酸检测方法有反转录-聚合酶链反应试验(RT-PCR)和荧光RT-PCR(Realtime RT-PCR)试验。传统的SVA检测方法存在需要使用高成本仪器设备，试验所需时间较长等缺点。RT-PCR和Realtime RT-PCR虽然较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等特点，但是上述方法均只能实现定性和半定量的检测，无法对病毒核酸进行精确定量，在灵敏度和敏感性特异性上仍存在一定的局限性。

微滴式数字化PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)将传统定量PCR的一个test变成20,000-30,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度。ddPCR系统包括：微滴发生器和微滴分析仪，及其相关的耗材。微滴发生器将每个样品分成20,000-30,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。随后微滴在PCR板上，开展终点PCR扩增。采用微滴分析仪(droplet reader)逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。与传统的定量PCR相比，数字PCR的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字PCR技术，研究人员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。

目前针对A型塞内卡病毒尚没有理想的微滴数字PCR检测方法，因此需要提供一种A型塞内卡病毒微滴数字PCR检测引物、探针及其应用以解决现有技术的问题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种精确度、灵敏度佳的A型塞内卡病毒微滴数字PCR检测引物、探针及其应用。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

一种A型塞内卡病毒的微滴数字PCR检测引物，所述引物的核苷酸序列为：

上游引物F：5’-TGCACCCCTTCGCTGACTACGGT-3’(SEQ ID No.1)；

下游引物R：5’-GAGTTCTCCCAGAATCGCCG-3’(SEQ ID No.2)。

一种A型塞内卡病毒的微滴数字PCR检测探针，所述探针的核苷酸序列为：

探针P：5’-GCCTTGTTCGACTGACCTGG-3’(SEQ ID No.3)。

优选地，本发明的探针P为：