[发明专利]一种双T-DNA载体pBID-RT Enhanced及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种双T‑DNA载体pBID‑RT Enhanced及其构建方法和应用，涉及转基因技术领域；所述载体以pCAMBIA3300的质粒为基础，包含两个反向独立的T‑DNA区，第一T‑DNA区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二T‑DNA区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用所述载体可降低T‑DNA整合到连锁位点的频率，T₁代和F₁代中无标记转基因植株占76.92％；利用所述载体可获得抗草铵膦转基因油菜以及既抗草铵膦又抗草甘膦转基因油菜。利用本发明的所述载体可以成功并且高效的生产无标记转基因甘蓝型油菜植株，并创造两种抗除草剂品种。

技术领域

本发明属于遗传转化技术领域，具体涉及一种双T-DNA载体pBID-RT Enhanced及其构建方法和应用。

背景技术

甘蓝型油菜(B.napus L.)是世界上最重要的油料作物之一，是生产富含蛋白质产品的主要植物。为了满足日益增长的需求，有必要利用遗传工程方法改良现有的品种和创造新的优良甘蓝型油菜品种，这为创造具有改良性状和不能通过传统育种方法获得的理想特征的新品种提供了另一种途径。自首次报道成功改造甘蓝型油菜以来，目前已利用农杆菌介导系统成功地将遗传转化技术用于甘蓝型油菜改良。许多重要特性的改良，包括除草剂，昆虫以及真菌抗性，以及改善油脂成分和蛋白质，已通过转基因方法引入甘蓝型油菜。转基因甘蓝型油菜的安全性与其他转基因作物面临着同样的问题和争论，其中一个问题是选择标记基因的关注。

目标基因的遗传转化过程需要同时伴随转化其他的抗生素或抗除草剂的选择标记基因，以帮助选择携带目标基因的阳性转基因植物。一旦转基因植株得到再生和鉴定，就不再需要选择标记基因。此外，带有标记基因的转基因植物不仅影响了公众的接受度，而且增加了标记基因导入亲缘杂草和非转基因作物的环境风险。这些因素使转基因植物商业化的监管过程复杂化。此外，对于不同基因进行多次转化，标记基因则会限制了这种多基因叠加过程。因此，生产无标记转基因甘蓝型油菜品种将有利于甘蓝型油菜的开发和最终的商业化利用。

迄今为止，已经开发了许多能够去除可选择标记基因的方法，包括共转化、位点特异性重组和同源重组。在这些方法中，共转化是一种简单、清洁的技术，并且在删除了标记基因的的转基因植物中不留下反向重复和重组位点等残留DNA序列，因而得到了广泛的应用。共转化是指一个T-DNA携带标记基因和另一个T-DNA携带目标基因的同时整合到基因组，如果两个基因整合到一个非连锁的位点上，那么它们在后代中的随后就会发生重组和分离。共转化在许多物种中都有应用，包括大豆、烟草、玉米、高粱、水稻和硬质小麦。但是利用现有的共转化技术，“双T-DNA”载体是通过将“右边框和左边框”序列插入二元载体一个T-DNA中而构建的；且多是将GUS作为目标基因，Bar作为标记基因，最后获得的是具有GUS，去除Bar的无标记植株，没有应用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种双T-DNA载体pBID-RT Enhanced及其构建方法和应用，降低T-DNA整合到连锁位点的频率，从而提高无标记转基因植株的出现概率，同时获得多种具有实际应用价值的转基因材料。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种双T-DNA载体pBID-RT Enhanced，所述载体pBID-RT Enhanced以pCAMBIA3300的质粒为基础，包含两个反向独立的T-DNA区，第一T-DNA区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二T-DNA区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述第一T-DNA区和第二T-DNA区之间的距离大于2kb。

优选的，所述第一T-DNA区包含选择标记基因，所述选择标记基因包括CP4-EPSPS基因和GOX-V247基因；所述CP4-EPSPS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述GOX-V247基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。