[发明专利]用于定位在流体通道的内表面上的结构的显微镜

说明书

本申请涉及用于定位在流体通道的内表面上的结构的显微镜。显微镜具有基准掩模和将准直掩模图像生成到分束器上的基准透镜，分束器将光学图像引导至物镜，在物镜处，光学图像被引导至由流体通道的内表面的折射率的变化形成的光学不连续点。反射光能通过物镜、分束器和检测器透镜被引导到检测器。当流体通道的内表面在离物镜的焦距处时，聚焦图像形成，提供在流体通道的内表面处的荧光标记物的成像。

发明领域

本发明涉及显微镜。特别是，本发明涉及用于在部分反射界面上聚焦和定位在部分反射界面处的结构的显微镜，其中存在多个部分反射界面。

发明背景

在某些行业(例如基因测序和基因研究)中，检测核苷酸是需要的，核苷酸是构成核酸的核苷酸的特征性化学部分(characteristic chemical moieties)。五种核酸碱基——腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)——被称为初级的或标准的。它们起遗传密码的基本单位的作用，碱基A、G、C和T存在于DNA中，而A、G、C和U存在于RNA中。在自然界中也发现了稀有碱基，例如5-甲基胞嘧啶和其他甲基化碱基、5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶和5-碳酰胞嘧啶。其他非标准碱基包括异鸟嘌呤、异胞嘧啶和通用碱基(例如肌苷)。

可以使用对每种类型的核酸碱基特定的荧光标记法(fluorescent labeling)来检测这些核苷酸。荧光标记法的类型包括直接标记法和间接标记法，直接标记法是通过核酸与荧光标记物的共价标记法或者通过荧光染料至核酸的非共价结合或嵌入而进行的，以及间接标记法是经由二级标记物至核酸的共价附着且然后将其结合到荧光标记的配体结合剂而进行的。可选的间接策略涉及核酸到用荧光团标记的核酸结合剂分子(例如，抗体、抗生素、组蛋白、抗体、核酸酶)的结合。用于核酸的荧光标记物包括有机荧光染料、金属螯合物、碳纳米管、量子点、金颗粒和荧光矿物。

荧光标记物优选地在暴露于宽带光源时在独特的波长处发荧光，从而提供用于在二维(2D)空间图像中识别受试者核苷酸中的每一个的方法。

荧光标记物结合到位于流体通道的表面上的核苷酸，且荧光标记物对激发源的不必要的暴露引起“光漂白”，一种时间现象(temporal phenomenon)，其中标记物的激发随着时间的推移导致减少的荧光光输出。这是在现有技术中的一个问题，在现有技术中，施加标记物活化能，并且通过使用荧光标记物作为聚焦目标来聚焦显微镜，从而在显微镜聚焦间隔期间将标记暴露于光漂白能。因为荧光标记物小且放大倍数大，所以显微镜图像聚焦的范围短，并且荧光标记物直到在锐聚焦的窄范围内才出现。在显微镜聚焦的这个时间间隔期间，光漂白出现，这减少了使荧光标记物成像可采用的光能，从而降低了在检测器处的信噪比。另外，荧光标记光强相对较低，在使用荧光标记物作为聚焦目标时增加了聚焦的难度。

希望提供一种显微镜，该显微镜提供用于聚焦流体通道的内表面(例如核苷酸和相关联的荧光标记物可以聚集的表面)，接着施加荧光活化能以使流体通道的内表面和相关联的荧光标记物成像。

发明目的

本发明的第一个目的是具有被照亮的基准图案的显微镜，被照亮的基准图案位于距基准透镜的基准透镜焦距处，来自基准透镜的光能被引导至分束器和物镜，该物镜位于距具有内表面的流动池的可调节距离处，物镜在检测器透镜的光轴上，检测器透镜接收通过分束器的光能并将光能聚焦到检测器，显微镜由此被配置为将基准图案定位到足以形成部分反射界面的流动池的折射率的变化上，并使显微镜聚焦到流体通道的内表面上。

本发明的第二个目的是一种用于在具有折射率的变化的界面处使流体通道的内表面成像的方法，该方法包括形成准直基准图案光能并将准直基准图案光能引导到离流动池可调节距离的物镜，其中从流体通道界面反射的光能被引导到检测器透镜并聚焦到检测器上，该方法包括首先调节可调节距离，直到基准图案在检测器处呈现为聚焦图像为止，以及随后用操作来使在流体通道的内表面处的标记物发荧光的光能照射流动池，并在检测器处形成图像。