[发明专利]一种快速检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的RDA方法及试剂盒

说明书

本发明公开一种快速检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的RDA方法及试剂盒，包括特异性引物对以及RDA荧光标记探针，以实现对柯萨奇病毒A16型（CA16）、肠道病毒71型（EV71）进行安全、特异、灵敏、简便的检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。此方法提供的试剂盒可省去核酸提取步骤，并在37～42℃恒温条件下、20min内实现柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的检测，特异性为100％，非常适用于现场快速检测。与普通PCR方法相比，RDA荧光法是在恒温下反应，不需变温，不需复杂仪器，而且反应时间短。因此，本发明的方法及其试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、成本低廉等特点，为柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种基于RDA荧光法检测技术检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸的引物对、探针及相关试剂盒。

背景技术

手足口病(Hand-foot-and-mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，其中以柯萨奇病毒A16型(Coxsachie virus 16，CA16)和肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)最为常见。手足口病是一种婴幼儿常见的传染病，多发生于5岁以下儿童，表现为发热，口痛，厌食，手、足和口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，多数患儿一周左右自愈。手足口病病毒可通过直接接触感染者鼻咽分泌物、唾液、疱疹液或粪便进行传播。肠道病毒感染，潜伏周期为2～10天，平均3～5天，感染者发病后，一周内传染性最强，传染期可持续数周，再加上患者多为婴幼儿，病情发展快，所以更需要早期、及时发现疾病。

传统的肠道病毒检测方法包括病毒分离检测、血清免疫检测以及PCR核酸检测等方法。其中病毒分离检测方法周期长不适用临床检测，血清免疫检测的方法结果可靠性差，PCR检测法如常规PCR、RT-PCR、实时荧光定量PCR等，在病原微生物的检测方向作用重大，但其一般需要能够进行精密控温的仪器和实验室，并且对检测人员的操作要求较高，不适用于样品的现场检测，不利于基层推广，无法满足疾病防控简单、快速、准确的检测要求。疾病的早期发现和及时诊断，对疾病的诊疗和预后判断有重要的临床意义，因此建立HFMD快速检测方法尤为重要。

随着体外核酸恒温扩增的悄然兴起，传统扩增技术的局限性有所改变，在过去的十年中，使核酸体外扩增变得更加简单和方便的一些等温核酸扩增技术已得到快速发展，如LAMP（环介导核酸扩增技术）、HDA（解旋酶依赖等温核酸扩增技术）等均可在等温条件下扩增病毒核酸。这些技术只需要温度控制装置来保持一个恒定反应温度，就可以实现高效的核酸扩增，从而得以摆脱对精密控制温度变化的 PCR 仪的依赖。若能在常温条件下实现核酸的扩增，将进一步使核酸扩增技术简单化，并有利于此类技术更广范围的应用。及时准确地发现传染病疫情对于疾病的防治和疫情的控制具有重要意义，因此研究和开发一种能在基层诊疗机构使用，在常温下快速检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型两种核酸的试剂盒非常有必要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有柯萨奇病毒A16型（CA16）、肠道病毒71型（EV71）检测技术的缺陷和不足，研究得到一种同时检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型两种核酸的RDA荧光法检测试剂盒，实现对柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的快速检测，整个检测过程，从样本处理到结果完成，仅需20-30min，比常规的检测时间大大缩短，从而提高检测效率。

本发明目的在于，提供优选后的用于检测手足口病病毒的探针，所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO .1-4任一所示，其中SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .3的探针用于检测柯萨奇病毒A16型(CA16)，SEQ ID NO .2或SEQ ID NO .4的探针用于检测肠道病毒71型(EV71)。

本发明另一个目的在于，提供优选后的同时检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的引物对及探针。