[发明专利]一种通用型疫苗免疫增强剂

说明书

本发明涉及一种通用型疫苗免疫增强剂制备与应用。所述通用型疫苗免疫增强剂通过利用基因重组技术，将非致病大肠杆菌鞭毛蛋白Flic与不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的融合蛋白编码基因以及轮状病毒VP2/VP6融合蛋白类病毒粒子编码基因经过柔性linker连接，分别克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵、纯化、复性折叠类病毒粒子、混合制剂等工艺，得到一种通用型疫苗免疫增强剂。所述疫苗免疫增强剂可与常规灭活疫苗、活疫苗以及核酸疫苗、亚单位疫苗、多表位疫苗、蛋白工程疫苗等基因工程疫苗抗原混和后与佐剂乳化获得免疫原性增强型疫苗。动物实验表明，疫苗免疫增强剂能够有效地提高常规疫苗体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫反应水平。

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种通用型疫苗免疫增强剂制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将非致病大肠杆菌鞭毛蛋白Flic与不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的融合蛋白编码基因以及轮状病毒VP2/VP6融合蛋白类病毒粒子编码基因分别克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵、纯化、复性折叠类病毒粒子、混合制剂等工艺，得到一种通用型疫苗免疫增强剂以及该增强剂在疫苗中的应用。

背景技术

疫苗佐剂是制约新型疫苗发展的最主要瓶颈之一。理想的佐剂能显著减少抗原使用的剂量，有效诱导机体产生早期、高效和持久的免疫应答，并具有良好的安全性。因此，发现具有潜在佐剂活性的组合物，继而筛选和优化，并对佐剂的作用特点及作用机制进行研究，是研发安全、高效的疫苗、有效防控传染病的一个关键环节。

从20世纪80年代开始，已经有超过100种以上的病毒样颗粒(Virus likeparticles，VLPs)被制备且鉴定。VLPs由于具有安全性高，在结构上与病毒粒子相似，可通过与病毒粒子相同的途径激起免疫系统的有效应答等优点，近二十年来在人用、兽用疫苗及药物递送系统中的应用越来越受到关注。病毒样颗粒造成的免疫刺激主要包含：(1)由于多价的结构，通过toll样受体和模式识别受体途径刺激先天免疫。(2)诱导产生较强的体液免疫。(3)通过MHC I和MHC II类交叉提呈方式增强抗原提呈细胞摄取、加工、提呈。VLPs具有比表面积大可表面吸附具有反应基团的氨基酸(如赖氨酸、谷氨基酸等)，规则的空间结构，以及良好的生物相容性。这些特点极大地吸引了众多疫苗研发者的目光。VLPs作为免疫原有利于打破肿瘤和病毒慢性感染所产生的免疫耐受，使VLPs展示表位疫苗具备直接用于治疗的特性。因此，研发人员已开发了多种人用及动物用VLPs新型疫苗，但VLPs作为疫苗免疫增强剂的研究鲜有研发报道。

细菌的某些蛋白分子具有较强的免疫激活特性，并同时扮演着佐剂的角色，例如霍乱毒素(CT)、大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)、LT-K63以及用于结核病(TB)I期临床的佐剂Eurocine L3等，它们都显示了各自的优势。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB能与大多数动物的神经节苷脂GM1特异性结合，诱导细胞膜构型改变。近年来，鞭毛蛋白的佐剂活性越来越受到关注，大肠杆菌鞭毛蛋白本身作为一种免疫刺激物，可诱导机体产生天然免疫应答和获得性免疫应答。研究发现，鞭毛蛋白具有两种可引起促炎性反应的受体，糖脂、神经节苷酯和跨膜蛋白TLR5。作为一种模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)，TLR5在肺、肠上皮细胞、单核、巨噬细胞，和小肠的固有层未成熟树突状细胞上表达。鞭毛蛋白除了自身的强免疫原性外，还具有增强外源抗原免疫原性的特性，包括体液免疫和细胞免疫。

发明概述

本发明将非致病大肠杆菌鞭毛蛋白Flic与不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的融合蛋白编码基因以及轮状病毒VP2/VP6融合蛋白类病毒粒子编码基因分别克隆入载体，在大肠杆菌中表达后，经过蛋白纯化、复性折叠类病毒粒子、制剂等工艺，获得具有理想免疫增强效果的组合物：免疫增强剂。免疫增强剂与常规灭活疫苗、活疫苗、基因工程疫苗等按照一定比例混合乳化后免疫靶动物，可诱导更高水平的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫反应。