[发明专利]高频跨境媒介昆虫携带的细菌核酸快速提取扩增试剂盒

权利要求书

1.高频跨境媒介昆虫携带的细菌核酸快速提取扩增试剂盒，所述的高频跨境媒介昆虫携带的细菌核酸快速提取扩增试剂盒的整体结构由盛液瓶(1)、冷冻瓶(2)、常温箱(3)、冷冻箱(4)、试剂盒盖(5)、试剂盒体(6)、试剂盒合页(7)、试剂盒锁扣(8)、盛液瓶固板(9)组成；所用试剂包括PCR反应液、高成功率PCR酶、裂解缓冲液、标签引物，其特征在于，目的片段的扩增采用的标签引物，其核苷酸序列如Seq ID No：1和Seq ID No：2所示。

2.根据权利要求1所述的高频跨境媒介昆虫携带的细菌核酸快速提取扩增试剂盒，其特征在于：所述的高频跨境媒介昆虫携带的细菌核酸快速提取扩增试剂盒的整体结构由盛液瓶(1)、冷冻瓶(2)、常温箱(3)、冷冻箱(4)、试剂盒盖(5)、试剂盒体(6)、试剂盒合页(7)、试剂盒锁扣(8)、盛液瓶固板(9)组成，盛液瓶(1)是盛放缓冲液和ddH₂O等能够在常温下储藏的液体试剂的瓶子，为玻璃质或塑料质，由瓶体和瓶盖构成，盛放液体的总体积为100-150毫升，瓶体下部为瓶身，瓶身呈圆柱形，瓶身内表面平滑，圆柱形瓶身的直径为5-10厘米，高度为5-10厘米；瓶体上部为瓶颈，瓶颈下部呈圆台形，圆台的下缘与瓶身上缘连接在一起，圆台的上缘与瓶颈上部的下缘连接在一起，瓶颈上部呈圆柱形，圆柱形瓶颈的直径为3-5厘米，高度为2-3厘米，瓶颈上部的外表面具有突出的螺纹；所有的盛液瓶(1)均放置在常温箱(3)内；冷冻瓶(2)是盛放dNTP、高成功率PCR酶、正向引物、反向引物、模板DNA等常温下储藏的液体试剂的瓶子，为玻璃质或塑料质，由瓶体和瓶盖构成，盛放液体的总体积为0.5-10毫升，瓶体下部为瓶身，瓶身呈圆柱形，瓶身内表面平滑，圆柱形瓶身的直径为1-3厘米，高度为3-5厘米；瓶体上部为瓶颈，瓶颈下部呈圆台形，圆台的下缘与瓶身上缘连接在一起，圆台的上缘与瓶颈上部的下缘连接在一起，瓶颈上部呈圆柱形，圆柱形瓶颈的直径为0.5-1厘米，高度为0.5-1厘米，瓶颈上部的外表面具有突出的螺纹；所有的冷冻瓶(2)均放置在冷冻箱(4)内；冷冻箱(4)是内置有冰袋的泡沫箱；冷冻箱(4)上部是冷冻箱盖(11)，下部为冷冻箱体(10)，冷冻瓶(2)和维持低温的冰袋即放置在冷冻箱体(10)内；冷冻箱盖(11)四周壁的厚度为1-2厘米，冷冻箱盖(11)顶壁的厚度为1.5-3厘米；冷冻箱体(10)四周壁的厚度为1.5-3厘米，底壁的厚度为2-3厘米，冷冻箱体(10)四周壁上缘内侧向上有个厚度为0.5厘米的凸起，凸起的高度为1-2厘米；常温箱(3)是试剂盒体(6)内放置冷冻箱(4)后剩余的空间；常温箱(3)内有盛液瓶固板(9)，盛液瓶固板(9)设置在常温箱(3)中部，为纸质、塑料质、铝合金质或不锈钢质，上面有相间排列的圆孔，圆孔的直径为5-10厘米；高频跨境媒介昆虫携带的细菌核酸快速提取扩增试剂盒为塑料质、铝合金质或不锈钢质，呈长方体形，长方体的长度为15-30厘米，宽度为10-20厘米，高频跨境媒介昆虫携带的细菌核酸快速提取扩增试剂盒的上部为试剂盒盖(5)，下部为试剂盒体(6)，试剂盒盖(5)和试剂盒体(6)借助试剂盒合页(7)可动连接在一起；试剂盒盖(5)四周壁厚度为1-10毫米，顶壁厚3-15毫米；试剂盒体(6)四周壁的厚度为3-15毫米，底壁的厚度为5-15毫米，试剂盒体(6)四周壁上缘内侧向上有个厚度为0.5-1毫米的凸起，凸起的高度为0.5-1厘米；试剂盒合页(7)为公知的合页，包括2个合页片，2个合页片之间由轴相连，每个合页片均为不锈钢质，呈长方体形，长方体的长度为2-3厘米，宽度为1-2厘米，厚度为0.5-1毫米；试剂盒锁扣(8)结构同公知的锁扣结构，可动的锁鼻固定在试剂盒盖(5)侧壁外表面，锁鼻上有个长方形的孔，不动的锁扣固定在试剂盒体(6)侧壁外表面，锁扣上有可内缩进的弹条。

3.根据权利要求1所述的高频跨境媒介昆虫携带的细菌核酸快速提取扩增试剂盒，其特征在于：所述的高频跨境媒介昆虫携带的细菌核酸快速提取扩增试剂盒使用包括以下步骤：

(1)高频跨境媒介生物体表携带细菌的收集：取1只病媒昆虫或鼠的组织(毛、足、耳等非内脏组织)置于适中的离心管中，加入可浸没该高频跨境媒介生物的0.9％NaCl溶液，800r/min漩涡振荡30s，短暂离心；收集上清转移至新的离心管中13,800×g离心2min；弃上清，留沉淀；重复以上步骤3次；将收集的细菌沉淀物，加入500μL 0.9％NaCl溶液悬浮后合并，4℃保存备用；收集废弃液和废弃物高压灭菌后丢弃；

(2)高频跨境媒介生物体内携带细菌的收集：若是提取鼠体内细菌，取其内脏组织进行实验，无需进行(1)的处理直接进行该步骤；将(1)处理后高频跨境媒介生物移入新的灭菌离心管中，加入可浸没高频跨境媒介生物的75％乙醇浸泡5min，重复3次；将高频跨境媒介生物转移至另一个新的灭菌离心管中，然后加入可浸没高频跨境媒介生物的0.9％NaCl溶液，800r/min漩涡振荡30s，弃上清，以上步骤重复3次；将样本放置在生物安全柜中晾干15min；用灭菌镊子将样本移入新离心管中，将标本研碎成糊状；加入3mL生理盐水，800r/min漩涡振荡30s，短暂离心，将上清液转移至新的10mL离心管中，13,800×g离心2min，弃上清，留沉淀；重复以上收集步骤3次，将收集的细菌沉淀物，加入500μL 0.9％NaCl溶液悬浮后合并，4℃保存备用；收集废弃液和废弃物高压灭菌后丢弃；

(3)整只高频跨境媒介生物携带细菌的收集：取1只高频跨境媒介生物或组织置于适中的离心管中，将标本研碎成糊状；根据样本大小加入适量0.9％NaCl溶液，800r/min漩涡振荡30s，短暂离心，将上清液转移至新的离心管中，13,800×g离心2min，弃上清，留沉淀；重复以上收集步骤3次，将收集的细菌沉淀物，加入500μL 0.9％NaCl溶液悬浮后合并，4℃保存备用；收集废弃液和废弃物高压灭菌后丢弃；

(4)细菌基因组DNA的提取：将装有菌液的离心管13800×g离心2min，转移上清液并高压灭菌处理；收集的细菌使用细菌基因组DNA提取试剂盒(含溶菌酶消化)或使用核酸自动提取仪提取细菌基因组DNA，提取的基因组DNA保存在4℃冰箱作为模板DNA备用；

(5)目的片段的扩增：以步骤(4)获取的基因组DNA为模板，采用标签引物：正向引物341F(5′-TCAGAGCTACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和反向引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)进行PCR扩增，得到高频跨境媒介生物携带细菌的的16S的V3～V4高变区基因序列；PCR扩增体系(50μL)：缓冲液(2×)25μL，dNTP(2mmol/L)2.5μL，高成功率PCR酶(1U/μL)1μL，正向引物(20μmol/L)1μL，反向引物(20μmol/L)1μL，模板DNA 3μL，ddH₂O 16.5μL；PCR扩增条件：94℃预变性2min；98℃变性10s，50℃退火30s，68℃延伸30s，30个循环；68℃延伸10min；10℃保温；

(6)PCR产物浓度测定：使用DNA浓度测定仪对PCR产物浓度和质量进行检测，以DNA溶解溶液做参比，分别测定样品溶液在260nm、280nm、230nm、270nm处的吸收值，计算A260/A280，A260/A230，A260/A270的比值，同时满足以下条件的DNA样品可视为质量高的基因组DNA：A260/A280为1.8～1.9，A260/A230＞2.0，A260/A270为1.1～1.3；利用A260＝1相当于50μg/mL的双链DNA计算DNA浓度，要求PCR产物的DNA总量≥2μg，浓度≥50ng/μL。