[发明专利]牛卵母细胞的体外受精和胚胎培养的方法和运输培养液

权利要求书

1.一种牛体外受精胚胎培养的方法，其包括如下步骤：

(1)卵母细胞的采集和体外成熟

a)离体采集：取屠宰场所得牛卵巢，抽取表面2-8mm的卵泡，收集沉淀，在体视显微镜下捡出至少含有3层卵丘细胞包裹的卵母细胞COCs即卵丘-卵母细胞复合体，放入包含HEPES的运输培养液中38.8℃、无二氧化碳供应、24h内运回实验室；

b)将以上离体采集所得COCs在卵母细胞成熟培养液中洗涤1次，再转移到新的成熟培养液中培养22-24h，培养条件为38.8℃、5.5-6.5% CO₂、饱和湿度；

(2)体外受精

将成熟的COCs在受精培养液中洗涤1次，再转移到受精培养液中，放入培养箱中，备用；

从液氮中取一支冻精细管，37℃水浴解冻；无菌操作剪开细管两端，使精液注入盛有精液制备培养液的15mL离心管中，328×g离心2次，每次5min，离心后弃上清；将300µL精液制备培养液加入上述离心管，重悬精子沉淀，取适当的精子悬液进行精子计数；

将计算好体积的精子悬液加入盛有卵母细胞的受精培养液滴中，并将培养盘放入培养箱，使精卵共孵育16-20h，培养条件为38.8℃、5.5-6.5% CO₂、饱和湿度；

(3)胚胎体外培养及保存

体外受精操作完毕后，将胚胎周围的颗粒细胞用剥卵针去除干净，放入胚胎培养液中培养，此时记为胚胎培养的第1天，培养条件为38.8℃、6% O₂、88% N₂、饱和湿度，第3天记录卵裂率；第7天记录囊胚率，至第9天时统计囊胚孵化率，并进行质量鉴定；

将可用胚胎在保存液中洗涤3次，在平衡液中平衡10min后转移入冷冻液，按5段装液法装入胚胎，做好标记，再放入程序降温仪中按照0.5℃/min的速度降至-35℃后，将胚胎细管迅速取出，置入液氮中冷冻保存，

其中：

所述成熟培养液是添加了100mL/L FBS、10μg/mL FSH、10μg/mL LH、1μg/mL E₂、20ng/mLEGF的BY基础培养液；

所述运输培养液中包含：甘氨酸50.0mg/L、L-丙氨酸25.0mg/L、L-精氨酸盐酸盐70.0mg/L、L-天冬氨酸30.0mg/L、L-胱氨酸二盐酸盐26.0mg/L、L-谷氨酸75.0mg/L、L-谷氨酰胺100.0mg/L、L-组氨酸盐酸盐一水合物21.88mg/L、L-羟基脯氨酸10.0mg/L、L-异亮氨酸40.0mg/L、L-亮氨酸60.0mg/L、L-赖氨酸盐酸盐70.0mg/L、L-甲硫氨酸15.0mg/L、L-苯丙氨酸25.0mg/L、L-脯氨酸40.0mg/L、L-丝氨酸25.0mg/L、L-苏氨酸30.0mg/L、L-色氨酸10.0mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物58.0mg/L、L-缬氨酸25.0mg/L、抗坏血酸0.05mg/L、生物素0.01mg/L、氯化胆碱0.5mg/L、D-泛酸钙0.01mg/L、叶酸0.01mg/L、甲萘醌0.01mg/L、烟酰胺0.025mg/L、烟酸0.025mg/L、对氨基苯甲酸0.05mg/L、盐酸吡哆醛0.025mg/L、盐酸吡哆醇0.025mg/L、核黄素0.01mg/L、盐酸硫胺素0.01mg/L、维生素A醋酸酯0.1mg/L、维生素D₂即骨化醇0.1mg/L、α-生育酚磷酸钠盐0.01mg/L、肌醇0.05mg/L、无水氯化钙200.0mg/L、硝酸铁九水合物0.7mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钾400.0mg/L、氯化钠6800.0mg/L、磷酸二氢钠一水合物140.0mg/L、硫酸腺嘌呤10.0mg/L、5'-磷酸腺苷0.2mg/L、三磷酸腺苷1.0mg/L、胆固醇0.2mg/L、葡萄糖1000.0mg/L、脱氧核糖0.5mg/L、还原型谷胱甘肽0.05mg/L、盐酸鸟嘌呤0.3mg/L、次黄嘌呤钠0.354mg/L、酚红20.0mg/L、核糖0.5mg/L、醋酸钠50.0mg/L、胸腺嘧啶0.3mg/L、20.0mg/L吐温80、尿嘧啶0.3mg/L、黄嘌呤钠0.3mg/L，以及0.01IU/mL的FSH、0.01IU/mL的LH、1μg/mL的E₂，50ng/mL的EGF、100ng/mL的IGF、10%庆大霉素、55µg/mL丙酮酸钠、1.2mM/L半胱氨酸、3mg/mL的BSA、10mM/L的HEPES、30~50mg/L牛磺酸、1~3mg/L葡萄糖酸锌；

所述受精培养液是包含112.0mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM氯化钙二水合物、0.52mM六水氯化镁、0.83mM磷酸二氢钾、37.0mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的水溶液；

所述精液制备培养液是包含112.0mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM氯化钙二水合物、0.52mM六水氯化镁、0.83mM磷酸二氢钾、37.0mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白、10mM咖啡因、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的水溶液；

所述胚胎培养液包含：109.5mM氯化钠、3.1mM氯化钾、26.2mM碳酸氢钠、0.8mM六水氯化镁、1.19mM磷酸二氢钾、0.4mM丙酮酸钠、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸钙、2.5v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺1mM、2v/v%必需氨基酸、1v/v%非必须氨基酸、3mM谷胱甘肽、枸橼酸钠0.04w/v%、麦芽糖0.02w/v%的水溶液；所述必需氨基酸为以下氨基酸按重量比例添加：L-盐酸精氨酸6.32g、L-胱氨酸二盐酸盐1.564g、L-盐酸组氨酸一水物2.1g、L-异亮氨酸2.625g、L-亮氨酸2.62g、L-赖氨酸盐酸盐3.625g、L-蛋氨酸0.755g、L-苯丙氨酸1.65g、L-苏氨酸2.38g、L-色氨酸0.51g、L-酪氨酸1.8g和L-缬氨酸2.34g，所述非必须氨基酸为以下氨基酸按重量比例添加：L-丙氨酸0.89g、L-天门冬酰胺一水物1.5g、L-天冬氨酸1.33g、L-谷氨酸1.47g、甘氨酸0.75g、L-脯氨酸1.15g和L-丝氨酸1.05g；

所述BY基础培养液是包含如下组分的水溶液：氯化钙180~220mg/L、九水硝酸铁0.70~0.75mg/L、氯化钾380~420mg/L、硫酸镁90~100mg/L、氯化钠6500~7000mg/L、一水磷酸二氢钠130~150mg/L、碳酸氢钠2000~2500mg/L、醋酸钠40~60mg/L、L-丙氨酸20~30mg/L、L-精氨酸盐酸盐60~80mg/L、L-天冬氨酸25~35mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物0.10~0.12mg/L、L-胱氨酸二盐酸盐20~30mg/L、L-谷氨酸70~80mg/L、甘氨酸40~60mg/L、L-组氨酸盐酸盐一水合物20~25mg/L、L-羟脯氨酸8~12mg/L、L-异亮氨酸15~25mg/L、L-亮氨酸50~70mg/L、L-赖氨酸盐酸盐60~80mg/L、L-蛋氨酸10~20mg/L、L-苯丙氨酸20~30mg/L、L-脯氨酸30~50mg/L、L-丝氨酸20~30mg/L、L-苏氨酸25~35mg/L、L-色氨酸8~12mg/L、L-酪氨酸二钠二水合物55~60mg/L、L-缬氨酸20~30mg/L、抗坏血酸0.04~0.06mg/L、α-D-生育酚磷酸酯0.008~0.012mg/L、生物素0.008~0.012mg/L、骨化醇0.08~0.12mg/L、D-泛酸钙0.008~0.012mg/L、氯化胆碱0.4~0.6mg/L、叶酸0.008~0.012mg/L、肌醇0.04~0.06mg/L、三水合甲萘醌亚硫酸氢钠0.015~0.025mg/L、烟酸0.02~0.03mg/L、烟酰胺0.02~0.03mg/L、p-氨基苯甲酸0.04~0.06mg/L、盐酸吡哆辛0.04~0.06mg/L、核黄素0.008~0.012mg/L、盐酸硫胺素0.008~0.012mg/L、维生素A乙酸酯0.1~0.2mg/L、硫酸腺嘌呤8~12mg/L、腺嘌呤0.15~0.25mg/L、腺苷三磷酸二钠0.8~1.2mg/L、胆固醇0.15~0.25mg/L、2-脱氧-D-核糖0.4~0.6mg/L、D-葡萄糖800~1200mg/L、谷胱甘肽0.04~0.06mg/L、盐酸鸟嘌呤0.25~0.35mg/L、次黄嘌呤钠0.3~0.4mg/L、核糖0.4~0.6mg/L、胸腺素0.25~0.35mg/L、4~6mg/L吐温80、尿嘧啶0.25~0.35mg/L、黄嘌呤钠0.3~0.4mg/L、酚红8~12mg/L。