[发明专利]一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用

说明书

本发明涉及一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用，本发明能够通用检测四种常见人微孢子虫，即肠脑炎微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、毕氏肠微孢子虫、和海伦脑炎微孢子虫。本发明构建含有样品DNA和通用引物的PCR反应体系，PCR反应后进行凝胶电泳，根据电泳结果判断是否含有微孢子虫，显著提高了PCR法检测的特异性。

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用。

背景技术

微孢子虫(Microsporidia)是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物。是引起微孢子虫病的真菌类病原^[1]。在已知并被命名的1200多个微孢子虫中,共有8个属中的14个虫种可以感染人，其中较为常见的4种微孢子虫分别是：肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoonintestinalis)，兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)，毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)和海伦脑炎微孢子虫(Encephalitozoon hellem)。由于微孢子虫是一种机会性感染病原，HIV患者、肿瘤患者、移植受者、肺结核患者等免疫力低下的人群更容易受其感染。微孢子虫可侵染肠道、肝、肺、脑等部位，引起患者的慢性腹泻、肝炎、角膜炎、脑炎、血液系统性感染等症状，严重影响人类健康^[2]。

早期微孢子虫检测方法主要依赖于镜检法，凭借检测人的经验来判断。随着科学技术的发展，目前微孢子虫的主要检测方法有如下几种：荧光染色法、改良三色染色法、基于免疫学的ELISA检测法、以及基于分子生物学的实时定量PCR法等^[3]。其中分子生物学方法因其速度快、准确性高等特点成为微孢子虫检测的金标准。目前检测人微孢子虫的分子生物学方法多是基于微孢子虫核糖体RNA内转录间隔区(ITS)，可以对微孢子虫进行种间的鉴别。市面上还没有能够同时检测4种常见人微孢子虫的方法，目前只有一种针对毕氏肠微孢子虫 (Enterocytozoon bieneusi)的试剂盒。该试剂盒针对毕氏肠微孢子虫的ITS设计引物，应用实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)对毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)进行检测。

由于微孢子虫的SSUrRNA在进化过程中具有保守性强的特点，且其序列中含有可变区和高变区，既可以用于设计微孢子虫检测通用引物，又可以用于进行微孢子虫种间的鉴别^[4]。 1995年，Daniel P.Fedorko等人根据4种常见人微孢子虫SSUrRNA的编码DNA设计了一对通用引物，能够检测这4种人微孢子虫(Forward：5’-CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC-3’；Reverse：5’-CCTCTCCGGAACCAAACCCTG-3’)^[5]，但该引物存在检测特异性低的缺陷。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物，包含：

正向引物：5’-CACCAGGTTGATTCTGCCTGACGT-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

反向引物：5’-CCTCTCCGGAACCAAACCCTGAT-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述的四种人微孢子虫为肠脑炎微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、毕氏肠微孢子虫、和海伦脑炎微孢子虫。

2、一种试剂盒，含有上述通用引物。

优选的，所述试剂盒还包含聚合酶r-Taq、DNAMaker、阳性对照和双蒸水，所述阳性对照为四种人微孢子虫SSUrRNA的DNA片段。