[发明专利]一种PCR扩增产物的检测方法

说明书

本发明公开了一种PCR扩增产物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在PCR反应体系中添加荧光染料和非离子去污剂，然后进行PCR扩增；其中，所述荧光染料在PCR反应体系中的浓度为0.1‑1×，所述非离子去污剂在PCR反应体系中的浓度为0.1‑0.5％；(2)将步骤(1)得到的体系在紫外灯照射下于暗场肉眼观察或经荧光成像系统照相后观察，通过体系颜色判断PCR扩增产物的有无。对于通过有或无反应进行判断的PCR鉴定，本发明可不经凝胶电泳，在PCR管内利用荧光成像系统或肉眼观察直接判定，简化了实验程序，减少了实验操作，节省时间提高效率。

技术领域

本发明涉及扩增产物鉴定，具体涉及一种PCR扩增产物的检测方法。

背景技术

PCR(聚合酶链式反应)是一种用于扩增放大特定DNA片段的分子生物学技术，在生命科学相关领域有十分广泛的应用，而对其产物的分析检测及判定方法则直接影响PCR检测的效率。目前，PCR技术在生产中最普遍的应用是通过判定其特定产物片段的有无以识别特定基因、基因型或基因组，如病原微生物的鉴定、特定动物源成份的识别、性别鉴定、转基因成份鉴定等。PCR扩增后对产物识别分析鉴定主要有以下几种方法：

1、凝胶电泳，又可分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。琼脂糖凝胶电泳是实验室最常用的方法，简便易行，其原理是不同大小的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶时，由于电泳速度不同而被分离，经溴化乙锭(EB)或其他荧光染料染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。聚丙烯酰胺凝胶电泳原理类似，但制胶过程及显色比琼脂糖凝胶电泳繁琐，检测水平也更精密，在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。

但利用凝胶电泳检测PCR产物最大的问题在于，胶面大，制胶及电泳时间长，且由于需要取出PCR产物进行点样电泳，容易造成PCR产物污染，而且一旦污染较难去除。

2、根据荧光曲线判定，即直接在PCR反应体系中加入荧光染料(如SYBR Green)，荧光染料可以结合到双链DNA上面，当体系中的模板被扩增时，荧光染料可以有效结合到新合成的双链上面，随着PCR的进行，结合的荧光染料越来越多，被仪器检测到的荧光信号越来越强，根据PCR扩增荧光曲线的趋势即可判定有无目的产物出现。这种判定方法需要有荧光定量PCR仪并且需要特定荧光染料，成本较高，使用这种方法仅用于判定产物的有无显然投入回报率太低，因此较少使用。

近年出现的一种新的基因扩增方法，环介导等温扩增(LAMP)，其扩增产物鉴定则十分简便，可通过肉眼观察反应体系浊度、颜色或荧光变化来直接判断反应产物的有无。在LAMP技术显然无法完全替代PCR检测的前提下，一个普遍被关心的问题是，既然都是基因扩增方法，LAMP扩增产物鉴定方法能否应用于PCR反应中以轻松鉴别PCR结果？答案是否定的。这是因为LAMP在反应过程中，由于其反应效率高，扩增产物量大约是PCR的10-100倍，因此反应中dNTP会大量解离出焦磷酸根离子，与溶液中的镁离子相结合生成焦磷酸镁白色沉淀，产生浊度的变化，而焦磷酸镁的生成量和DNA的扩增量呈正相关。虽然普通的PCR也会产生焦磷酸盐，但由于其生成量很少，不能用于结果观察。利用这一特性LAMP还可以通过在反应产物中添加金属离子络合剂或金属离子指示剂，通过其结合不同金属离子而呈现不同颜色的这一特性来判断反应是否进行，如钙黄绿素(Calcein)、羟基萘酚蓝(HNB)这两种试剂都可以通过反应体系颜色的变化来判断反应是否进行，实现对反应的可视化观察，大大提高了反应的检测效率。

同样，由于LAMP扩增产物生成量大，可直接在反应体系中加入荧光染料如SYBRGreen，反应完成后不经电泳，扩增产物在反应管内直接经紫外光照射，根据其荧光强度的变化肉眼即可鉴别反应是否发生。而对PCR反应，由于扩增产物浓度较LAMP低一到两个数量级，产物DNA即使结合荧光染料，其荧光强度变化也不足以与阴性对照(反应本底)相区别，难以通过肉眼或荧光成像对反应结果进行判定。

发明内容