[发明专利]一种利用大肠杆菌生产2’-岩藻糖基乳糖的方法

说明书

本发明公开了一种埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3用于生产2’‑岩藻糖基乳糖的用途，所述埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3的保藏号为CCTCC 2018200。本发明利用高产可拉酸的大肠杆菌菌种Escherichia coli S17‑3以乳糖作为唯一底物从头合成2’‑岩藻糖基乳糖，没有外源表达GDP‑L‑岩藻糖的合成途径。本发明生产2’‑岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的发酵方法，将其发酵产量提高了10倍以上，最高产量达到617.0mg/L，产量大大提高。

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种利用大肠杆菌生产2’-岩藻糖基乳糖的方法。

背景技术

近年来，许多研究表明母乳寡糖(HMOs)通过抵御胃肠道病原微生物感染和维持胃肠 道微生态平衡，对婴儿的健康成长具有若干积极方面的作用。与其他哺乳动物乳相比，人 乳有很多独特的低聚糖，可为人类健康提供各种生物活性，如益生元效应，预防病原体感 染和免疫系统调节。据文献报道，2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)是参与如上所述生物功能的主 要人乳寡糖之一，这使得该功能性寡糖在营养保健和药物用途方面受到极大关注。

最简单的HMO是三糖或短链乳寡糖。2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL；Fuc-α1,2-Gal-β1,4-Glc)是母 乳中最丰富的单岩藻糖基乳糖衍生物。研究显示，HMOs对婴儿的几种有益作用，包括选 择性增强双歧杆菌生长，对病原体的抗粘附作用和对肠上皮细胞的糖组变化作用。此外， 婴儿的营养中含有2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)与较低的腹泻率相关，如果能以足够的量和合 理的价格获得，则使2’-FL成为潜在的营养补充剂和治疗剂。

鉴于寡糖的重要生物功能和生理活性,为阐明其作用机制,需要制备大量结构均一的该 类化合物，然而从天然产物中分离提取所得到的量很少，远不及研究的需要，因此通过人 工合成的方法获得该类化合物就成为最佳选择。目前寡糖的合成策略主要包括：酶法合成(化 学酶法)以及单细胞发酵合成。

酶法合成中，利用糖苷酶催化合成寡糖有两种模式：其一是逆水解反应，是单糖与醇 的缩合反应，水是离去基团，这一过程是以游离糖为底物，称为“直接糖基化”或“逆水解”过程，但这一过程得到的产物通常收率比较低。所以目前应用较多的是第二种模式： 转糖基反应(transglycosylation),离去基团通常是特定活化的苷元或糖基。

近年来不断有文献报道实现了在微生物体内合成2’-FL。等利用乳糖和甘 油作为底物，将来自幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)的岩藻糖基化酶(FutC) 整合至大肠杆菌JM109的基因组，首次实现了大肠杆菌无抗生素筛选生产2’-FL，最终补料 分批发酵培养的浓度为20.28g/L；Lee等只利用乳糖作为底物，通过过表达内源GDP-L-fucose合成酶以及异源岩藻糖基转移酶，在分批补料发酵实验中，得到2’-FL的最大终浓度为1.23g/L；Christoph等克隆并过表达来自H.pylori的α-1，2-fucosyltransferase (FucT2)，以酶合成的GDP-L-fucose和乳糖为底物合成2’-FL，使用阴离子交换色谱和凝 胶过滤得到2’-FL的分离产率为65％；Chin等在工程化改造的大肠杆菌BL21中，通过修 饰乳糖操纵子为lacZΔM15，同时在异源表达FucT2的N端添加三个天冬氨酸盐分子，最 终分批补料发酵获得的2’-FL终浓度为6.4g/L；Huang等在大肠杆菌中，通过筛选高效的 岩藻糖基转移酶和宿主菌株，提升供体GDP-L-fucose和受体乳糖的活性，并提升辅因子 NADPH的含量，最终得到的2’-FL和3’-FL终浓度分别为9.12g/L和12.43g/L。