[发明专利]一种破骨细胞前体和间充质干细胞作为种子细胞的基质依赖型组织工程骨及其构建方法

权利要求书

1.一种破骨细胞前体和间充质干细胞作为种子细胞的基质依赖型组织工程骨的构建方法，其特征在于，将间充质干细胞和破骨细胞前体按10:1比例，种植于多孔骨支架材料上构建组织工程复合体，再在体外加入成骨诱导培养液继续培养12～14天，在-70～80℃冷冻48～72小时，冻干24小时～30小时，获得基质依赖型组织工程骨。

2.如权利要求1所述的一种破骨细胞前体和间充质干细胞作为种子细胞的基质依赖型组织工程骨的构建方法，其特征在于，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞。

3.如权利要求2所述的一种破骨细胞前体和间充质干细胞作为种子细胞的基质依赖型组织工程骨的构建方法，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

4.如权利要求1所述的一种破骨细胞前体和间充质干细胞作为种子细胞的基质依赖型组织工程骨的构建方法，其特征在于，所述多孔骨支架材料为脱细胞骨基质或脱钙骨基质。

5.如权利要求4所述的一种破骨细胞前体和间充质干细胞作为种子细胞的基质依赖型组织工程骨的构建方法，其特征在于，所述多孔骨支架材料为脱钙骨基质。

6.如权利要求1至5任一项所述的一种破骨细胞前体和间充质干细胞作为种子细胞的基质依赖型组织工程骨的构建方法，其特征在于，取脱钙骨基质支架材料，用DMEM培养基浸泡48小时，调节pH值为7.2；取第二代处于指数增长期的间充质干细胞，用PBS洗涤后，用0.1wt％I型胶原酶溶液孵育1小时，再加入含0.25wt％胰酶与0.02wt％EDTA的溶液消化3～5分钟，用含10wt％胎牛血清的DMEM培养基洗涤并重悬，与破骨细胞前体按照10:1进行混合重悬；将细胞接种至前述处理后的脱钙骨基质支架材料上，使细胞悬液刚好浸润支架材料且不溢出支架材料之外；3小时后在无菌操作条件下将脱钙骨基质支架材料的底面翻转变成顶面，同前述方法接种细胞悬液；细胞支架0.5cm×0.5cm×0.3cm规则大小，种植细胞总数大约10⁶，3小时后加入DMEM培养基至刚好没过脱钙骨基质支架材料的顶面，再在37℃、5％CO₂条件下培养；24小时后，在体外对其进行成骨分化诱导培养12～14天；在-70～80℃冷冻48～72小时，冻干24小时～30小时，冷冻保存3个月以显著降低免疫原性，形成基于破骨细胞前体和间充质干细胞作为种子细胞的基质依赖型组织工程骨。

7.根据权利要求6所述的一种破骨细胞前体和间充质干细胞作为种子细胞的基质依赖型组织工程骨的构建方法，其特征在于，所述的破骨细胞前体来自于经100ng/ml的RANKL与50ng/ml的M-CSF破骨方向诱导分化24小时的骨髓单核细胞。

8.采用权利要求1～7任一项所述方法构建的一种破骨细胞前体和间充质干细胞作为种子细胞的基质依赖型组织工程骨。