[发明专利]一种具有三维成像能力的显微镜和成像方法

说明书

本发明公开了一种具有三维成像能力的显微镜及其显微方法，所述显微镜包括：至少一个激发装置，用于沿激发主轴方向在样品待测区域内产生可探测的衬度；至少一个探测装置，用于沿探测主轴方向探测样品待测区域内产生的衬度；至少一个移动机构，用于产生样品与所述激发装置和探测装置的相对运动；其中，所述相对运动的方向与所述激发主轴方向既不平行也不垂直；所述相对运动的方向与所述探测主轴方向既不平行也不垂直。本发明可以减少三维成像中的成像停顿，包括样品移动的同时不间断的成像，减少必须中断成像的视野转换，同时消除成像时样品运动引起的模糊，改善引起的像差。

本申请是申请号为201610951388.2，申请日为2016年10月26日，发明名称为“一种具有三维成像能力的显微镜和成像方法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及成像显微镜和显微成像方法，特别是涉及一种以生物和医学为主要应用领域的高通量三维数字成像显微镜和高通量三维数字显微成像方法。

背景技术

三维数字成像是现代显微成像的重要内容之一。在不降低分辨率的前提下非破坏的成像更多样品是三维显微成像方法的重要追求。

一般的，三维数字成像以某种产生衬度响应(如荧光)的方法探测样品(激发)，以某种方法记录这些衬度(光电转换并数字化)，并以待测区域内每一个体单元的衬度数字化为体像素作为最终产出。以此，体像素的数目，即样品待测区域的体积除以体像素对应的体积(由要求的分辨率决定)，和数字化的速度决定了三维数字成像速度的一个上限。然而现有技术的成像速度远未达到这一极限。以现有的主流成像设备400兆像素每秒的数字化(16bit)速度为例对0.5立方厘米的小鼠大脑成像，三维体像素对应1×1×1微米的单元(亚细胞分辨)的数字成像速度上限应为1250秒，大约21分钟；体像素对应5×5×5微米单元(胞体分辨)则仅需10秒。现有技术中，亚微米分辨率的鼠脑成像代表速度为3天(Gong，H.eta1.Nat.Commun.7∶12142，2016)，胞体分辨的最新结果约为2小时(Li Ye，et a1.，Cell，165(7)，16June 2016，)。以现有技术而言，激发和记录的速度不是瓶颈。造成这一差距的一个重要原因是现有技术无法在成像过程中避免成像中断，从而使有效成像时间缩短。

现有成像技术通常采用这样的方案：首先对与成像方向(即探测主轴方向，通常称之为z方向)垂直的一个平面成像——可以是逐点成像或者部分/整个视野同时成像，以扫描共聚焦(scanning confocal)或光切片(SPIM，有时也缩写为LSM)成像为例；在z方向上根据分辨率要求做相对运动，到达一个新的平面，这一过程约需10毫秒；对新平面成像；重复以上运动与成像，直到在z方向上覆盖样品，完成一个视野内的三维成像，然后在垂直于z的方向上移动到一个新视野，这一过程约需多达数百毫秒；重复以上运动与成像，直到在垂直于z的方向上也覆盖样品，完成样品的三维成像。以上过程中包含了大量的中断成像的过程，每次移动本身花费时间，并要进一步等待启动、停止引起的振动耗散，才能开始继续成像，从而产生长时间的成像中断。在样品体积较大，分辨率要求较高的情况下，上述中断成像的次数以三次方增大，严重影响成像的效率。部分技术以电调焦透镜等方案减少中断成像时间，但仅适用于z方向，且尺度有很大限制，对三维数字成像的通量仅有部分的改善。