[发明专利]一种线粒体DNA损伤的标志物及其应用

说明书

本发明公开了一种线粒体DNA损伤的标志物及其应用，其特征是包含有片段1、片段2、片段3运用于判断线粒体DNA损伤的标志。特别无机砷暴露所致线粒体DNA损伤，当片段1ΔCt：≥3.07而且片段2ΔCt≥3.20而且片段3ΔCt≥3.14，当同时满足上述三个条件即可判定为线粒体DNA损伤当片段1ΔCt+片段2ΔCt+片段3ΔCt≥9.53，满足即可判定为线粒体DNA损伤。为一种简单快速的方法。

技术领域

本发明属于生物标志物领域，具体地本发明涉及一种致粒体DNA损伤的标志物及其应用。该标志可以很好的反应砷导致的线粒体DNA损伤。

背景技术

砷是地球上最常见的类金属之一。由于其无处不在的性质，它对全球健康构成重大威胁。根据化学周期表，砷、氮、磷是同一族的元素，砷与生物组织相互作用的典型理化特性可能导致其具有多种显著的生物学效应。砷暴露会导致一些人类系统的癌症，如皮肤、呼吸系统、肝胆系统和泌尿系统。此外，砷暴露可能导致多种动脉粥样硬化性血管疾病的发生，如脑血管事件、心肌梗死和周围血管疾病，所以判断砷引起的早期效应非常重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够判断线粒体DNA损伤的标志物及其应用1.片段1、片段2、片段3。以及运用于判断线粒体DNA损伤的标志特别是判断无机砷暴露所致线粒体DNA损伤的标志。判断规则是片段1ΔCt：≥3.07而且片段2ΔCt≥3.20而且片段3ΔCt≥3.14，当同时满足上述三个条件即可判定为线粒体DNA损伤。判断规则或者是是片段1ΔCt+片段2ΔCt+片段3ΔCt≥9.53，满足即可判定为线粒体DNA损伤。可以判断人线粒体外周血淋巴细胞线粒体DNA损伤。本研究受国家自然科学基金的支持（81860572）。

本发明（优点）：方法非常简单可以通过提取外周血DNA后进行荧光定量检测从而判定线粒体DNA损伤，整个过程仅仅需要2-3个小时，外周血需要量仅为20ul以上，成本低，器材简单，通过5个副孔，最大程度减少变异。

具体实施方式

下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

具体实施方式。

实施例

在取得知情同意后，收集砷制造厂73名工人为高暴露组即为有DNA损伤，普通人群17人为低暴露组即未有DNA损伤，采集外周血及尿液。尿砷测定分析用冷阱捕集－氢化物发生原子分光光度计。采取磷酸盐缓冲液提取淋巴细胞，采用DNA提取试剂盒提取DNA。

实时荧光定量PCR反应体系(15. 0μl ) 包括, 7.5μl 荧光定量试剂，1μl基因组DNA,1.5μl 引物上下游引物为（5μlmo l/L）, 去离子水5μl。PCR 反应条件为95 ℃ 10min预变性，95 ℃ 10s、60 ℃ 10 s、72℃ 10 s 40个循环得到Ct值，每个反应5个副孔，增加数据确定性。使用β-actin作用内参，每个片段的损伤程度使用ΔCt值表示。ΔCt=Ct_片段-Ct_内参。

片段1上游引物：CCCTAGACCAAACCTACGCCAAA(SEQ ID NO.1)下游引物：AGGCCGAGAAAGTGTTGTGGGAA(SEQ ID NO.2)，片段2上游引物：ACAGATGCAATTCCCGGACGTCTA(SEQ ID NO.3)下游引物：GGCATGAAACTGTGGTTTGCTCCA(SEQ ID NO.4)，片段3上游引物：TCACTTCCACTCCATAACGCTCCT(SEQ ID NO.5)下游引物：GTGTTACATCGCGCCATCATTGGT(SEQ IDNO.6)，β-actin上游引物：CGGGAAATCGTGCGTGACAT(SEQ ID NO.7)下游引物：GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG(SEQ ID NO.8)。