[发明专利]香樟齿喙象不同虫态的荧光定量内参基因及其引物和应用

说明书

本发明公开了香樟齿喙象不同虫态的荧光定量内参基因及其引物和应用，属于林业昆虫分子生物学领域。该荧光定量内参基因为RPL28和RPS15基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。本发明通过香樟齿喙象的转录组测序数据库，选择了常用作内参基因的8个候选内参基因，通过5种算法评估候选内参基因的稳定性，获得了香樟齿喙象不同虫态的荧光定量内参基因，并设计了内参基因的实时荧光定量PCR引物，该引物特异性强，扩增效率高。本申请填补了香樟齿喙象不同虫态下没有内参基因的现状，为香樟齿喙象不同虫态条件下的相关功能基因的表达定量提供了可靠的分析依据。

技术领域

本发明属于林业昆虫分子生物学领域，具体涉及香樟齿喙象不同虫态的荧光定量内参基因及其引物和应用。

背景技术

香樟齿喙象(Pagiophloeus tsushimanus)为鞘翅目Coleptera，象甲科Curculionidae，齿喙象属Pagiophloeus，为中国新纪录种，是一种专食香樟的钻蛀性害虫。成虫主要取食1-2年生的嫩枝表皮，幼虫取食木质部与韧皮部之间的形成层，受危害严重的香樟长势衰弱或枯死。目前，香樟齿喙象仅分布于中国上海市。该虫在上海市1年发生1代，以幼虫和成虫越冬。目前，上海市各个生态公益林中的香樟林均有大面积受该虫危害，且存在向外蔓延的趋势。

由于香樟齿喙象是新纪录害虫，当前还未有关于香樟齿喙象功能基因的分子生物学研究。实时荧光定量Reverse transcription quantitative polymerase chainreaction(RT-qPCR)是功能基因表达量的一种精确的定量方法，但它依赖于合适的内参基因对功能基因的相对表达定量进行数据标准化。内参基因必须在特定的实验条件下稳定表达。目前还没有香樟齿喙象内参基因鉴定与筛选的研究报道。利用实时荧光定量方法探究香樟齿喙象不同虫态下功能基因的差异表达分析，就需要稳定可靠的内参基因。因此，有必要对该害虫不同虫态下的内参基因稳定性进行筛选，否则无法对该害虫功能基因的相对表达定量进行研究。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供香樟齿喙象不同虫态的荧光定量内参基因，满足实时荧光定量分析香樟齿喙象转录表达水平的要求，为香樟齿喙象不同虫态下的相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据；本发明所要解决的另一技术问题是提供香樟齿喙象不同虫态的荧光定量内参基因的引物；本发明所要解决的再一技术问题是提供上述基因及其引物在香樟齿喙象不同虫态荧光定量中的应用。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为：香樟齿喙象不同虫态的荧光定量内参基因，为RPL28和RPS15基因，其中，RPL28基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；RPS15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

所述的香樟齿喙象不同虫态的荧光定量内参基因的引物，RPL28基因的引物序列如下：

RPL28正向引物：5’-GCGGGTTGTCCCTTGTTAAA-3’；

RPL28反向引物：5’-GGGCTCTGTAAAGGTGCTTG-3’。

所述的香樟齿喙象不同虫态的荧光定量内参基因的引物，RPS15基因的引物序列如下：

RPS15正向引物：5’-AAGCCCGAGATGATTGGACA-3’；

RPS15反向引物：5’-ATGAACCTGGAACTGTGGGT-3’。

上述内参基因在香樟齿喙象不同虫态荧光定量中的应用。

RPL28基因的引物序列在香樟齿喙象不同虫态荧光定量中的应用。

RPS15基因的引物序列在香樟齿喙象不同虫态荧光定量中的应用。