[发明专利]一种长时间维持人原代肝细胞的功能状态的培养方法

说明书

本发明涉及医药技术领域，具体是一种长时间维持人原代肝细胞的功能状态的培养方法，所述的方法为以3×10⁴/cm²接种密度，在肝细胞扩增培养基中培养人原代肝细胞。本发明通过在肝细胞扩增培养基中高密度培养，可以至少在30天内维持原代肝细胞(PHH)功能，能够实现原代人肝细胞体外长时间培养和功能维持，为药物代谢评估和肝细胞治疗提供了基础保证。

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种长时间维持人原代肝细胞的功能状态的培养方法。

背景技术

原代人肝细胞(PHH)被认为是肝细胞治疗的最理想细胞，更是药物代谢评估和建模研究的金标准细胞。但是在PHH体外培养过程中，极低的增殖速率以及代谢功能的缺失阻碍了PHH的应用。其重要原因在于，终末分化细胞在体内功能的稳定高度依赖于微环境信号的精确时空调控，而分离出的原代细胞通常会失去其核心基因表达特征和特定功能。为了攻克这个难题，研究者提出了很多用来体外长期维持肝细胞功能的方法，包括3D成球培养，胶原-凝胶三明治培养，与非实质细胞共培养，肝基因的表观调控以及通过增加氧供等方式优化培养微环境。但这些培养方法需要特殊的培养设备和复杂操作技术，这就在一定程度上限制了PHH用于评估药物有效性分析方法的选择，以及在高通量测序中的适用性。(参考文献：Gómez-Lechón M J,Tolosa L,Conde I,et al.Competency of different cellmodels to predict human hepatotoxic drugs.Expert Opin Drug Metab Toxicol,2014,10(11):1553-1568.；Xu J,Du Y,Deng H.Direct Lineage Reprogramming:Strategies,Mechanisms,and Applications.Cell Stem Cell,2015,16(2):119-134.)

Deng在研究中发现，通过使用5个小分子(5C培养基)：forskolin,SB431542,DAPT,IWP2和LDN193189，可以维持低温保存和新鲜分离的PHH的肝功能长达30天，并且5C培养的肝细胞具有CYP代谢活性以及乙肝病毒感染的能力。(参考文献：Xiang C,Du Y,Meng G,etal.Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes invitro.Science,2019,364(6438):399-402.)

发明内容

本发明的目的在于提供一种长时间维持人原代肝细胞的功能状态的培养方法。鉴于细胞功能的体外长期维持需要复杂的信号调节网络，我们发明了一种使用小分子组合的化学策略通过调节内在信号网络以实现对特定细胞靶点的调控。这种体外通过小分子组合长期维持肝细胞数量和功能的方法，在药物代谢评估和体外建模中具有一定应用价值，为药物代谢评估和肝细胞治疗提供了基础保证。

本发明的第一方面，提供一种在体外长时间维持人原代肝细胞的功能状态的培养方法，所述的方法为以2×10⁴-3×10⁴/cm²接种密度，在肝细胞扩增培养基中培养人原代肝细胞(低于这个密度，原代肝细胞会发生可逆转化，转化为肝前体细胞；高于这个密度，原代肝细胞可能会出现细胞密度过高，加速肝细胞衰老死亡进程)。

进一步的，所述的接种密度为3×10⁴/cm²。

进一步的，所述的肝细胞扩增培养基为：

液体基础培养基为DMEM/F12，1％胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液，50ng/ml表皮生长因子，20ng/ml白介素-6，20ng/ml肝细胞生长因子，20ng/ml成纤维细胞生长因子-2，1μM的CHIR9902，10μM的Y-27632，1.25μM的Acetylcysteine和1μM的A83-01。