[发明专利]一种快速鉴定酿酒厌氧微生物的方法

权利要求书

1.一种快速鉴定酿酒厌氧微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、厌氧培养液配置：取过磷酸钾、磷酸钾、氯化钠、硫酸铵、氯化镁、硫酸钾、刃天青、L－半胱氨酸、L－抗坏血酸、碳酸氢钠、蛋白胨、蒸馏水mL，将上述原料混合均匀，制得厌氧培养液，待用；

S2、菌悬液配置：将酒醅加入灭完菌的生理盐水于厌氧瓶中，迅速盖紧瓶盖，在摇床上振荡，取出放入厌氧工作站中，吸取上清液加入灭菌后的厌氧培养液中进行厌氧菌富集培养，去除样品中的好氧菌，使厌氧菌大量繁殖，制得菌悬液，待用；

S3、菌落培养：在厌氧工作站中将菌悬液稀释到10^－2，取0．3mL涂平板，在40℃条件下培养1－2d，长出菌落后，选择合适的梯度，根据菌落的大小、形态、颜色、透明度、是否隆起等形态学特征挑选不同的单菌落，划线纯化；

S4、PCR扩增：根据细菌DNA提取试剂盒方法提取已分离的厌氧细菌DNA，采用细菌16SrDNA通用引物27f，对应于Escherich－iacoli16SrDNA、1492rDNA和E．coli16SrDNA的进行PCR扩增，取2.5μL PCR产物于2%琼脂糖凝胶60V电泳25min，在凝胶成像仪下观察；

S5、鉴定：在NCBI数据库中，经过Blast比对后，下载每株细菌相似性大于99%的几株细菌序列，并下载芽孢杆菌科各属模式菌株系列，以Escherichiacoli为外群，构建系统发育树，用MEGA5．05进行序列比对，并手工校正，用邻接法经1200次bootstrap进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定酿酒厌氧微生物的方法，其特征在于，在步骤S1中，取过磷酸钾0．18g、磷酸钾0．2993g、氯化钠0．35g、硫酸铵0．40g、氯化镁0．040g、硫酸钾0．085g、刃天青0．002g、L－半胱氨酸0．6g、L－抗坏血酸0．7g、碳酸氢钠5．0g、蛋白胨1．3g、蒸馏水1500mL，将上述原料混合均匀，制得厌氧培养液。

3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定酿酒厌氧微生物的方法，其特征在于，在步骤S2中，在氮气流下，称取15g酒醅加入灭完菌的95mL生理盐水于厌氧瓶中，迅速盖紧瓶盖，在50℃，200r/min摇床上振荡15min，取出放入厌氧工作站中，吸取0.2mL上清液加入灭菌后的厌氧培养液中进行厌氧菌富集培养，培养36h，去除样品中的好氧菌，使厌氧菌大量繁殖。

4.根据权利要求1所述的一种快速鉴定酿酒厌氧微生物的方法，其特征在于，在步骤S3中，还包括下述步骤：在厌氧工作站中，将已纯化的菌种接种到厌氧菌琼脂上，分别放入40℃恒温生化培养箱和40℃厌氧工作站中培养2d，观察，若在生化培养箱和厌氧工作箱中均生长，则为兼性厌氧菌，在厌氧培养箱中生长而在生化培养箱中不生长，则为严格厌氧菌。

5.根据权利要求1所述的一种快速鉴定酿酒厌氧微生物的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述PCR扩增条件为：于90℃预变性10min，于90℃变性8min，于60℃退火8min，于75℃延伸2min，如此30个循环，最后75℃保持15min。