[发明专利]恒温扩增检测新型冠状病毒的引物对、试剂盒、试剂盒的制备方法及应用

权利要求书

1.一种恒温扩增检测新型冠状病毒的引物对，所述新型冠状病毒具体为2019-nCoV，其特征在于，所述引物对如SEQ ID NO.1-8所示，在SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.4/SEQ ID NO.6/SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列中的5’端标记地高辛或荧光基团。

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，在SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3/SEQ IDNO.5/SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列中的5’端均标记生物素，在SEQ ID NO.2/SEQ IDNO.4/SEQ ID NO.6/SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列中的5’端依次标记FAM、TAMRA、Dig和AMCA。

3.一种检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：扩增反应液、酶冻干粉及芯片，所述扩增反应液中包含权利要求1或2所述的引物，所述芯片包括用于检测新型冠状病毒的试纸条，所述试纸条上包含有若干抗体，若干所述抗体分别作为权利要求1或2所述的引物的相应检测标记。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试纸条上包含的所述抗体为抗FITC、抗AMCA、抗罗丹明、抗毛地黄素抗体中的一种或多种；

所述扩增反应液还包括反应体系、逆转录酶和/或核酸内切酶；所述扩增反应液与所述酶冻干粉分别盛装，使用前将两者混合均匀；

所述反应体系为TwistDx公司的RPA反应体系，或所述反应体系的配方为：终浓度为40mM的TrisAc缓冲液、终浓度为140mM的KOAc、终浓度为7％的甘露、终浓度为6％海藻糖、终浓度为100mM的dNTPs、终浓度为200μM的ATP、终浓度为20ng/μL的肌酸激酶、终浓度为100ng/μL的磷酸肌酸二钠盐、终浓度为20μM的DTT和终浓度为10μg/ml的BSA；

所述逆转录酶为AMV逆转录酶或MMLV；

所述核酸内切酶为HindIII和/或大肠杆菌核酸内切酶III；

所述酶冻干粉为TwistDx公司的RPA酶冻干粉，或使用以下浓度的混合酶进行冻干：终浓度为120ng/μL的T4UVSX蛋白、终浓度为30ng/μL的T4UvSY蛋白、终浓度为40ng/μL的T4gp32蛋白、终浓度为0.1U/μL的BSU或klenow片段，冻干骨架为蔗糖。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照和阳性对照，其中阳性对照为通过盔甲RNA方法制备的含扩增片段的假病毒，阴性对照为灭活人细胞培养液或含有内标片段的序列。

6.一种检测新型冠状病毒试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒为权利要求3至5任一项所述的试剂盒，所述制备方法包括扩增反应液的制备和芯片的制备；

所述芯片的制备包括：储液槽的制备、试纸条的制备、芯片组装、芯片检测及芯片包装，其中所述储液槽的制备和所述试纸条的制备的顺序能够调整。

7.根据权利要求6所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述扩增反应液的配制是按照所有引物0.8μL/5人份、反应体系29.5μL/5人份、逆转录酶和/或核酸内切酶0.5μL/5人份的比例配制而成；

所述储液槽的制备过程包括：

1)配制稀释液，向芯片储液槽中加入上述配好的稀释液，对缓冲液区域进行密封；

2)配制醋酸镁溶液，向储液槽加样区加入配制好的醋酸镁溶液，自然风干；

所述试纸条的制备过程包括：

1)配制点样液，并在试纸条的固相载体上进行点样、固定及封闭；

2)乳胶微球的活化及偶联体的标记，并将玻纤膜浸入活化后的乳胶微球中，烘干得到结合垫；

3)样品垫的制备，配制样品垫处理液，将另一玻纤膜浸入所述样品垫处理液中，烘干得到样本垫；

4)试纸条的组装，将背光板前部贴膜撕开，贴上结合垫，结合垫前段伸出固相载体并与样品垫接触，将背光板后部贴膜撕开，贴上吸水纸；

5)试纸条的切条；

其中，所述试纸条的制备过程中步骤1)至步骤3)的顺序能够调整。