[发明专利]一种先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的检测方法

说明书

本发明公开了一种先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的检测方法，包括以下步骤：a.利用二代测序对样本进行检测；b.将测序结果分为基因型明确和基因型不明确；c.对基因型不明确的样本进行RT‑PCR、单细胞单点突变验证和微量蛋白检测，明确基因分型。本发明为临床解决先天性骨髓衰竭性疾病的基因分型治疗提供快速准确及有效的检测手段，为IBMFS患儿的后期治疗及临床预后提供依据；本发明提高了此类疾病总体的诊断水平，并可为其他系统遗传性疾病的诊断提供可参考方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的检测方法。

背景技术

先天性骨髓衰竭综合征（Inherited bone marrow failure syndromes, IBMFS）是一组以骨髓衰竭、先天畸形及易发生肿瘤为主要表现的疾病的总称。IBMFS包括范可尼贫血（Fanconi anemia, FA）、先天性角化不良（dyskeratosis congenita, DC）、先天性胰腺脂肪过多症（Shwachman-diamond syndrome, SDS）、无巨核细胞性血小板减少（Amegakaryocytic thrombocytopenia）、先天性纯红细胞再生障碍性贫血（diamond-blackfan anemia, DBA）、网状组织发育不良（reticular dysgenesis）、家族性再生障碍性贫血（Familial aplastic anemia）、伴桡骨缺失的血小板减少症（TAR）、严重的先天性中性粒细胞减少症等。诊断这些疾病的重要依据是较典型的临床表现、家族史、染色体断裂实验、互补试验、细胞周期实验、western blot蛋白检测方法、基因检测等，由于基因检测对疾病分型、预后及后期治疗尤为重要，故通过基因检测进行诊断及分型已成为国际目前普遍采用的疾病诊断及分型手段。

为了对IBMFS患儿进行准确的诊断，前期设计了包含儿童骨髓衰竭性疾病的基因突变检测试剂盒，目前在临床已应用5年，检测病例800余例，在对结果的分析中，发现一些问题，这也是目前国内外进行二代测序检测后遇到的共同问题，包括：1.同一位患者同时检测出两种甚至多种疾病相关的基因突变；2.同一患者检测出同一类疾病不同基因的杂合突变；3.突变基因的致病性不明确；这些问题的出现，严重影响了对疾病的精确分型，对患者的临床预后及治疗产生了困惑。另外，现在基因的检测技术仅是在基因层面对疾病进行分析，突变后基因编码蛋白的功能是否有缺陷不能得到很好的印证，虽然普通的westernblot技术可对蛋白的表达及功能作出初步判断，但其需要细胞量大、实验周期长，尤其对细胞量少的骨髓衰竭患儿更难开展，故此方法在临床很难普遍应用。

单细胞测序技术是指在单个细胞的水平上对基因组进行高通量测序分析的技术。2011年和2013年，单细胞测序技术分别被《自然一方法(Nature Methods)》和《科学(Science)》列为年度最值得期待和关注的技术之一，该技术已经用于海洋微生物的多样性研究、和肾透明细胞癌、及骨髓增殖性肿瘤等的研究，能更加精确地测量细胞内的基因突变情况。而传统的赖以进行高通量测序的DNA来源于大量细胞，其结果只是这个细胞群体的“平均值”。众所周知，细胞之间存在异质性，即使表型相同，细胞的遗传信息也可能具有显著差异，并且这种“整体表征”的做法，丢失了很多低丰度的信息。单细胞单点突变验证是基于单细胞DNA扩增后对已知突变位点进行分析的方法，这种方法不仅所需细胞量少，而且能反映出患儿不同细胞的克隆情况。能够很好的解释临床仅出现杂合或不同疾病基因杂合突变的情况尤为适用。

超微量蛋白分析仪是一种新的蛋白质分析系统，使用超微量蛋白分析仪的纳米技术的超微量蛋白免疫分析(nanofluidic proteomic immunoassay，NIA)方法可做到对少量样品（2000个细胞即可进行检测）、低丰度蛋白以及蛋白质翻译后修饰的定量研究。其工作原理主要是：蛋白质所处溶液的pH值不等于其等电点时蛋白质带有电荷，并会在电场中移动；当蛋白质处于稳定的pH值梯度中，即pH值等于等电点时蛋白质净电荷为0，在电场中不再移动，因此通过等电点分离，可以有效区分同一蛋白质的不同异构体及不同修饰。超微量蛋白分析仪则相当于更加灵敏和精准的微量western。