[发明专利]一种制备环状RNA的方法

权利要求书

1.一种制备环状RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，设计对T4 RNA连接酶2具有适当反应性的线性RNA底物，采用预测核酸二级结构的软件模拟要合成的环状RNA的二级结构，ΔG值＜0，模拟结果为结构①或结构②，所述结构①中间为凸环，凸环的两侧各有一个稳定的二级结构，凸环的长度为1-50nt；中间凸环两侧的稳定二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C和G-U三种碱基对，其余部分为任意长度的RNA或者任意的二级结构；所述结构②环状部位的一侧有一个稳定的二级结构，其环状部位的长度应为6-50nt，一侧的二级结构要求形成≥5bp的连续碱基互补配对，包括A-U、G-C和G-U三种碱基对；ΔG值＞0，模拟结果为结构③：结构③为环状结构，其长度为12-50nt；

步骤二，设计断开位点：1)当模拟结构符合结构①时，断开位点距稳定的二级结构3-10nt；2)当模拟得到的结构符合结构②时，断开位点距稳定的二级结构3-10nt；当模拟得到的结构符合结构③时，断开位点在该环状结构中的任一位置；

步骤三，按步骤二所设计的断开位点，合成新的线性RNA作为连接成环的底物，并进行5′端磷酸化修饰；

步骤四，将步骤三得到的线性RNA、T4 RNA连接酶2、连接酶缓冲液和RNA酶抑制剂混合，0-37℃下恒温反应2-12h；所述线性RNA的长度为12-319nt；所述连接酶缓冲液的浓度为标准浓度的0.05～2倍；当连接酶缓冲液终浓度为1×时，其组成为50mM Tris-HCl，25℃时pH为7.5；2mM MgCl₂,1mM DTT,400μM ATP。

2.根据权利要求1所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤四成环反应中线性RNA链不存在干扰T4 RNA连接酶2识别和结合的复杂二级结构。

3.根据权利要求1所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤四成环反应中线性RNA链3’端的倒数第一个和倒数第二个碱基均为核糖核苷酸，其余位置为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

4.根据权利要求1所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述结构①凸环的长度为12-30nt；所述结构②环状部位的长度为12-30nt；所述结构③环状结构的长度应为15-30nt。

5.根据权利要求1所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤四中线性RNA的长度大于12nt。

6.根据权利要求1所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤四中线性RNA的浓度为0.5-100μM。

7.根据权利要求1所述的制备环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤四中线性RNA的浓度为1-50μM。