[发明专利]一种用离子转运蛋白促进钝齿棒杆菌合成L-精氨酸的方法

说明书

本发明公开了一种用离子转运蛋白促进钝齿棒杆菌合成L‑精氨酸的方法，具体公开了一种通过过表达单价阳离子/H⁺逆转运蛋白Mrp1A以及阳离子转运ATP酶CTAP1提高L‑精氨酸产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明成功实现了对基因mrp1和ctap1的敲除和过表达，通过对胞内[Na⁺]和[K⁺]的测定，明确离子转运蛋白在离子浓度、pH稳态和渗透压方面的调节作用。采用5L发酵罐分批发酵策略，优化发酵条件，最终重组钝齿棒杆菌5‑5(mrp1ctap1)发酵至96h，重组菌的L‑精氨酸产量达到65.3g/L，产率为0.395g/g，比钝齿棒杆菌SYPA5‑5提高了39.1％。

技术领域

本发明公开了一种用离子转运蛋白促进钝齿棒杆菌合成L-精氨酸的方法，具体公开了一种通过过表达单价阳离子/H⁺逆转运蛋白Mrp1A以及阳离子转运ATP酶CTAP1提高L-精氨酸产量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-精氨酸(C₆H₁₄N₄O₂)是一种天然碱性氨基酸，其在食品添加剂、饲料和制药行业有着广泛的应用且有益于人类的生长发育。L-精氨酸具有多种生理功能与作用，广泛应用于人类生产生活，是氨基酸工业研究与开发的热点之一。在L-精氨酸合成过程中，离子转运为钝齿棒杆菌发酵提供适宜的胞内pH环境，同时维持离子稳态防止胞内出现高渗透压，是保证L-精氨酸高水平产量和产率的关键。

H⁺、K⁺和Na⁺是细菌中最关键、最重要的一价阳离子，在细菌的转运过程中发挥着至关重要的作用，因此离子在胞内外的分布影响着菌体的存活。细菌的转运系统也在不同的胞外环境下发挥作用，如碱性pH和高渗透压条件。H⁺用于调节胞内pH，从而保证适宜的胞内环境。K⁺是胞内含量最丰富的离子，参与多种细胞生理活动。其控制质膜电位，调节胞内pH，激活胞内酶。在酸性条件下，钝齿棒杆菌SYPA5-5的生长完全取决于K⁺的有效性和内部积累。此外，K⁺还可以作为一种渗透溶质，在高渗透压胁迫下，许多细菌迅速积累K⁺以恢复其膨胀压。Na⁺对细菌细胞的重要性通常归因于其在溶质吸收中的作用。

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)是一种钝齿状、无芽孢的革兰氏阳性菌，其生长迅速且可广泛使用不同的有机化合物作为碳源。该菌株不存在L-精氨酸脱氨酶，这使得胞内产生的L-精氨酸未被或有限度地被降解，对L-精氨酸的合成具有高效的促进作用，因此其突变株在国内的氨基酸生产中被广泛应用，但对其遗传背景的研究还处于空白状态。钝齿棒杆菌SYPA5-5是发明人课题组筛选得到的高产精氨酸突变菌株(菌株保藏编号为CGMCC NO.0890，在公开号为CN1441055A的专利中已公开)。

发明内容

本发明的目的在于利用一种过表达单价阳离子/H⁺逆转运蛋白Mrp1A和阳离子转运ATP酶CTAP1的重组钝齿棒杆菌发酵生产L-精氨酸，得到的L-精氨酸产量和产率均提高，对于规模化制备L-精氨酸具有重要的应用价值。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种重组钝齿棒杆菌，是过表达了单价阳离子/H⁺逆转运蛋白Mrp1A和阳离子转运ATP酶CTAP1；所述Mrp1A的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述CTAP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

优选地，编码所述Mrp1A的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，编码所述CTAP1的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述重组钝齿棒杆菌以pDXW-10作为原始表达载体。