[发明专利]一种基因工程改造后的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP‑lys，所述PCNP‑lys的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了一种抑菌剂，其主要活性成分为副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP‑lys、含有PCNP‑lys表达元件的载体，含有PCNP‑lys表达元件的表达盒或含有PCNP‑lys表达元件的宿主细胞中的至少一种。本发明还提供了一种副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP‑lys的制备方法。本发明的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP‑lys能够裂解多种致病弧菌，可以为耐药性副溶血性弧菌的替代疗法打下了基础。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，是关于一种基因工程改造后的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶及其制备方法和应用。

背景技术

副溶血性弧菌是弧菌属中一种最常见的致病菌种，它是一种具有直的和单一刚性曲线的革兰氏阴性，嗜盐的产孢杆菌，具有单一的极性鞭毛，在液体培养基中生长时能运动。这种细菌是一种人类病原体，天然存在于海洋环境中，经常从多种海产品中分离出来，包括鳕鱼，沙丁鱼，小龙虾，比目鱼，鲭鱼，蛤，章鱼，虾，蟹，扇贝和牡蛎。

根据粮食及农业组织报道，水产养殖是动物粮食生产增长最快的部门之一，支持全球约50％的人类和鱼类消费。食用被副溶血弧菌污染的未加工或未煮熟的海鲜，尤其是贝类，可能导致急性胃肠炎，其特征是腹泻，头痛，呕吐，恶心，腹部绞痛和低烧。对患有基础疾病如肝病或免疫疾病的人来说，感染也有可能导致败血症，危及生命。

目前抗生素的施用是治疗副溶血性弧菌感染的主要方法，抗生素的频繁使用已导致在水产养殖，农业和医学领域中耐药性病原细菌的频率增加。而且，如果应用于海洋孵化场，抗生素会扰乱水中的天然微生物平衡，以及幼虫发育的微生物群。此外抗生素还用于过去几十年的预防弧菌病，抗生素的过量使用，用于治疗弧菌病效果已经甚微，耐药菌的存在已成为人类和动物健康以及环境中不断增长的问题。控制所应用抗生素的数量和类型存在根本性的困难，因为它们的使用规定在不同国家之间可能有很大差异。由于很少有新的化学治疗药物被许可用于渔业，因此这个问题可能特别严重，多株耐药菌株的发现，天然微生物群的干扰，环境残留和公共卫生问题，因此，用生物方法替代化学疗法是必不可少的。

噬菌体是一组广泛分布于自然界中的病毒，其生命周期与细菌严格相关。它们被称为细菌寄生虫，因为它们缺乏食物摄取，蛋白质合成或新颗粒构建所必需的细胞结构和酶系统，所以它们只能依靠细菌复制和生长。噬菌体发现之初就作为对抗细菌的物质，但随后随着抗生素的发现，在20世纪40年代被西方遗弃。然而，近些年细菌多药耐药性的持续发展促使西方科学界重新评估噬菌体治疗细菌感染，这是传统方法无法治愈的。

噬菌体裂解酶是由噬菌体产生的高度进化的酶，可消化细菌细胞壁以释放噬菌体。这种水解酶有明显的抗菌活性，使之成为一种很好的抗菌药物。噬菌体裂解酶已成功用于多种动物模型中，以控制在粘膜表面或组织上发现的耐药菌的数量。噬菌体裂解酶优于抗生素的一点是它们具有特异性，只杀死病原体，不杀灭有益菌。在细菌对抗生素越来越适应的情况下，噬菌体裂解酶可能是非常重要的抗感染药。

噬菌体裂解酶主要作用于细菌细胞壁上的肽聚糖，因此，对革兰氏阳性菌有明显的裂解效果；但是对于革兰氏阴性菌来说，细菌细胞壁的脂多糖外膜阻碍了噬菌体裂解酶发挥裂解作用。因此，有必要研发一种可以抑制革兰氏阴性菌生长的抑菌物。

发明内容

本发明通过研究发现，将噬菌体裂解酶lys基因(ADX87518.1)的N端加两个连接有连接肽的PCNP多聚阳离子肽后，能够抑制致病性副溶血性弧菌的生长，具有杀致病性副溶血性弧菌的作用。因此，本发明的第一目的在于提供一种副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys，以抑制副溶血性弧菌的生长。本发明的第二个目的在于提供所述副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的制备方法。本发明的第三个目的在于所述副溶血性弧菌噬菌体裂解酶PCNP-lys的应用，为细菌耐药性提供一种选择。

为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：