[发明专利]一种基于比色法检测生物样品中NAD+

说明书

本申请公开了一种用于检测生物样品中NAD⁺含量的反应液，所述反应液包含反应液包含双苷肽，八肽胆囊收缩素(CCK‑8)，乙醇脱氢酶，烟酰胺和无水乙醇。本发明还提供了相应的试剂盒和检测方法。本发明提供的反应液和检测方法可以检测低至0.1μmol/L的NAD⁺，在0～1000nmol/L之间呈良好的线性关系，灵敏度更高，线性范围更宽。对于科学研究和临床评价都有着重要作用。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种基于比色法检测细胞及组织内NAD⁺含量的方法及其应用。

背景技术

NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，广泛存在于生命体内。NAD有两种存在形式，一种是氧化形式NAD⁺，另一种是还原形式NADH。在细胞内大部分氧化还原反应中起传递电子的作用。因此，维持适量水平的NAD对于机体的细胞呼吸功能非常重要。NAD有三种重要的合成途径：①是从头合成途径，通过限速酶NAMPT(Nicotinamide phosphoribosyltransferase)烟酰胺磷酸核糖转移酶来维持；②Preis-Handler passway，合成原料为食物中方摄取的烟酸(nicotinic acid)；③挽救途径，通过循环使用降解的NAD产物，比如烟酰胺。随着年龄的增长，NAD⁺和NAMPT 在多个组织器官中的水平都明显下降。NAD⁺的消失是细胞死亡的主要原因。 NAD在调节细胞氧化还原状态以及调控细胞信号转中都发挥重要的作用。

但目前的NAD检测方法对样品要求较高，需要在较短的时间内完成所有检测操作；显色的稳定性、灵敏度有待提高，当前的科学研究和临床评价亟需更好的NAD⁺含量的检测方法。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种显色稳定、灵敏度高的检测NAD⁺含量的反应液，同时提供一种更稳定、更灵敏的基于比色法检测NAD⁺含量的方法。

本发明公开了，一种用于检测生物样品中NAD⁺含量的反应液，所述反应液包含反应液包含双苷肽，八肽胆囊收缩素，其中各组分的浓度为：

双苷肽50mmol/L～100mmol/L；

CCK-8 0.1ml/L～0.5ml/L；

乙醇脱氢酶10单位/L～15单位/L；

烟酰胺100mmol/L～150mmol/L；

无水乙醇5％～10％。

根据本发明提供的反应液通过用CCK-8显色产生的甲瓒更加稳定且更易溶解于水，反应产物更加稳定，灵敏度更高。同时，本发明在显色方面相比 MTT法更为稳定，本发明的CCK-8法显色在显色后1小时内读数都可以得到很好的标准曲线图；同时，结合本发明在研究过程中检测人外周血实验结果来看，当血液样品加入0.5mol/L高氯酸后放入-80℃保存，在2个月内检测依旧稳定、灵敏、准确。

在根据本发明的一个实施方案中，所述的反应液为每毫升包含820μL 的61mmol/LpH7.4的双苷肽，100μL CCK-8，5μL 2.6千单位/mL乙醇脱氢酶，28.5μL的3.5mol/L烟酰胺，57μL无水乙醇。

本发明还提供了一种用于检测NAD⁺含量的试剂盒，所述试剂盒包含上述的反应液、样品裂解剂和pH中和剂。

在根据本发明的一个实施方案中，所述试剂盒中的样品裂解剂为高氯酸，所述pH剂中和剂为碱性试剂，优选地，所述pH中和剂为KOH水溶液或NaOH 水溶液。