[发明专利]光调控BK通道的融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种光调控BK通道的融合蛋白，其包括从N末端到C末端依次连接的细胞膜锚定序列、荧光蛋白、光敏蛋白LOV2结构域、以及BK钾离子通道特异性结合蛋白，所述细胞膜锚定序列、所述荧光蛋白、所述光敏蛋白LOV2结构域和所述BK钾离子通道特异性结合蛋白的连接方式为直接相连或通过连接肽相连。本发明的融合蛋白可在蓝光刺激的条件下，实现对内源性BK通道的功能调控。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及光调控BK通道的融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

离子通道是生命活动的基础之一，无论真核还是原核生物的细胞膜及各类细胞器膜上都存在着大量的离子通道。离子通道在维持膜内外离子环境的稳定，调控细胞的兴奋性，信号通路的激活等多种重要生理活动中都起到重要的作用。离子通道最重要的功能之一是调控细胞的电活动，进而影响神经递质释放、腺体分泌、肌肉收缩等生理活动。

大电导钙激活钾离子通道，简称为BK通道(Big potassium)，得名于其非常大的单通道电导(100～300ps)，以及其收到胞内钙离子浓度和膜电位改变的双重调控。对上述两种信号的整合，及其较大的单通道电导，使得BK通道起到了偶联胞内钙离子浓度与超极化钾电流的重要负反馈作用。BK通道的主体为α亚基的四聚体，分为S0-S6七个跨膜结构域和RCK1、 RCK2两个胞内结构域。(A.Pantazis,R.Olcese，Biophysics of BK ChannelGating，International Review of Neurobiology，128,1-49，2016)

光遗传学是现代神经科学广泛运用的一门科学，它使用基因工程技术，构建可以在活体动物细胞中表达的光敏蛋白，使用光刺激改变光敏蛋白的构象，引起不同生物学效应。在神经科学中，常用光遗传学工具激活或是抑制神经元的活动。

现有的光遗传工具可有效的调控神经元的兴奋性，神经元的激活可以使用ChR2为代表的光敏阳离子通道(Boyden,Zhang,Bamberg,Nagel and Deisseroth,Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity,NatureNeuroscience,8,1263-1268,2005)，神经元的抑制可以使用以eNpHR为代表的光敏氯离子通道，但这类激活抑制工具使用的是外源表达的离子通道等蛋白，难以实现对细胞本身的内源性离子通道的调控，另一类现有的离子通道调控策略是利用化学合成小分子化合物，实现对内源性离子通道的有效调控，但是时间分辨率和空间分辨率较差，难以实现精准调控，如经典的药理学工具河豚毒素(Tetrodotoxin， TTX)可以阻断内源钠离子通道，尼莫地平等二氢近年来，有研究合成了能够用光调控离子通道的小分子化合物，举例而言，如Acosta-Ruiz等人开发的PORTL工具(Acosta-Ruiz,Gutzeit,Skelly, Meadows,Lee,Parekh,Orr,Liston,Pleil,Broichhagen and Levitz,Branched PhotoswitchableTethered Ligands Enable Ultra-efficient Optical Control and Detection of GProtein-Coupled Receptors In Vivo,Neuron,2019)，能够与外源表达的融合有SNAP标签蛋白的代谢性谷氨酸受体结合，并用光调控该受体的活动。虽然该工具能够实现对离子通道的精确调控，但仍存在以下缺点，一，调控对象是外源谷氨酸受体而非内源受体，二，该工具依赖于化学合成，在制备方法上难度大于基因编码的蛋白工具。吡啶类药物可以阻断钙离子通道。