[发明专利]湿纸巾防腐效果的评价方法

权利要求书

1.湿纸巾防腐效果的评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1布片染菌：分别将制备的各种细菌菌液等比例混合，制备的各种真菌悬液等比例混合，得混合菌液；

将10片尺寸为15cm×20cm的湿纸巾试样分为细菌试样5片，真菌试样5片，试样平展后，在四个角落以及中间分别滴染0.2mL混合菌液，使每片细菌试样的细菌菌落数达2.5×10⁶cfu/片，使每片真菌试样的真菌菌落数达1.5×10⁶cfu/片，滴染后分别放入无菌瓶，分别标记为细菌0d、细菌7d、细菌14d、细菌21d、细菌28d，真菌0d、真菌7d、真菌14d、真菌21d、真菌28d；

分别于0d、7d、14d、21d、28d加入100mL稀释液作为洗脱液洗下湿纸巾试样上的微生物，稀释后取其中2个稀释度的稀释液1mL，置于灭菌平皿内，每个稀释液接种两个灭菌平皿，细菌用15mL凉至43℃的营养琼脂培养基作倾注，真菌用15mL凉至43℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基作倾注，转动平皿，使充分均匀，琼脂凝固后翻转平皿，细菌于35℃培养48h，真菌于28℃培养4d后，进行活菌菌落计数；

S2结果计算：M＝R×Z×100，式中，M为每个时间点细菌或真菌数量，R为稀释倍数；Z为两个平皿的菌落数的平均值，单位为cfu；100为洗脱液的用量，单位为mL；

S3评价方法：细菌总数从初始到14天的对数值减少值不能小于2.0，并且从14天到28天细菌数不能增加；真菌总数从初始到14天和28天不能增加，即说明湿纸巾具有防腐效果；

所述步骤S1中作为洗脱液的稀释液为PBS稀释液，PBS稀释液的制备方法为：称取无水磷酸氢二钠2.83g、磷酸二氢钾1.36g，加蒸馏水1000mL，待完全溶解后，调pH至7.2，经121℃压力蒸汽灭菌20min后备用；

所述细菌菌液包括金黄色葡萄球菌菌液、大肠杆菌菌液和铜绿假单胞菌菌液；

所述金黄色葡萄球菌菌液的制备方法为：

(1)取金黄色葡萄球菌冻干菌种管，冻干菌种管中冻干菌种的量为1.5×10⁷cfu/瓶，在无菌操作下打开，加入3mL营养肉汤培养基，轻柔吹吸，使菌种融化分散，得菌种悬液；取含8.0mL营养肉汤培养基的试管，滴入2mL菌种悬液，置37℃培养22h，用接种环取1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，置37℃培养22h，挑取2代中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养22h，即为第3代培养物；

(2)取菌种第3代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物，吸取4.0mL稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔，将洗液移至另一无菌试管中，使细菌悬浮均匀，得原始菌悬液；

(3)先用细菌浓度比浊测定法测定步骤(2)所得原始菌悬液的含菌浓度，然后用稀释液稀释至3×10⁸cfu/mL，即得；

所述大肠杆菌菌液、铜绿假单胞菌菌液的制备方法与金黄色葡萄球菌菌液的制备方法类似；

所述稀释液为PBS稀释液，PBS稀释液的制备方法为：称取无水磷酸氢二钠2.83g、磷酸二氢钾1.36g，加蒸馏水1000mL，待完全溶解后，调pH至7.2，经121℃压力蒸汽灭菌20min后备用；

所述真菌悬液包括白假丝酵母菌悬液和黑曲霉孢子悬液；

所述白假丝酵母菌悬液的制备方法为：

(a)取白假丝酵母冻干菌种管，冻干菌种管中冻干菌种的量为1.2×10⁶cfu/瓶，以无菌操作打开，用毛细吸管吸加3mL沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸，使菌种融化分散，得菌种悬液；取含6.0mL沙堡液体培养基的试管，滴入菌种悬液，置37℃培养20h，用接种环取第1代培养物中典型菌落，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，于37℃培养20h，挑取第二代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于37℃培养20h，即为第3代斜面培养物；

(b)试验时，将步骤(a)所得第3代斜面培养物在沙堡琼脂斜面上连续传代，方法与第3代相同，取第5代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物，吸取4.0mL稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔，将洗液移至另一无菌试管中，使白假丝酵母菌悬液均匀，得原始菌悬液；

(c)先用细菌浓度比浊测定法测定步骤(b)所得原始菌悬液的含菌浓度，然后用稀释液稀释至4×10⁷cfu/mL，即得；

所述黑曲霉孢子悬液的制备方法为：

(Ⅰ)取黑曲霉冻干菌种管，冻干菌种管中冻干菌种的量为1.3×10⁶cfu/瓶，以无菌操作打开，用毛细吸管吸取3mL生理盐水加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散，得沉淀物悬液；取沉淀物悬液加到含5.0mL沙氏葡萄糖琼脂培养基的试管中，置30℃培养45h，用接种环划线接种第1代培养物于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置30℃培养箱中培养45h，取平板培养物中的典型菌落，接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面，置30℃培养箱中培养45h，即为第3代斜面培养物；

(Ⅱ)试验时，取步骤(Ⅰ)所得第3代斜面培养物接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面，30℃培养8d，得黑曲霉分生孢子；

(Ⅲ)取6.0mL体积浓度为0.05％的吐温80生理盐水溶液，刮洗步骤(Ⅱ)所得黑曲霉分生孢子于溶液中，将孢子悬液移入无菌试管中，用已灭菌的脱脂棉滤过除去菌丝，滤过后，显微镜下观察是否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，经5600r/min离心20min，再次在显微镜下观察，若悬液中仍有菌丝存在，须再离心，直到无菌丝存在，使用时菌悬液的含菌量为2×10⁷cfu/mL；

所述稀释液为PBS稀释液，PBS稀释液的制备方法为：称取无水磷酸氢二钠2.83g、磷酸二氢钾1.36g，加蒸馏水1000mL，待完全溶解后，调pH至7.2，经121℃压力蒸汽灭菌20min后备用。