[发明专利]一种原核表达载体及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 202010102716.8 | 申请日： | 2020-02-19 |
| 公开（公告）号： | CN111172185A | 公开（公告）日： | 2020-05-19 |
| 发明（设计）人： | 郭抗抗;赵娣;张亮;张彦明;刘勇 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/66;C12P21/02;C07K14/18 |
| 代理公司： | 北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 王敏 |
| 地址： | 712100 *** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 表达 载体 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种原核表达载体，其特征在于，是由pET-32a改造获得的仅含单一his标签的原核表达载体。
2.根据权利要求1所述的一种原核表达载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)以pET-32a为原始载体，利用XhoⅠ、XbaⅠ双酶切pET-32a原核表达载体；
(2)合成两条含rbs序列及分别含有BamHⅠ、EcoRⅠ的酶切位点的单链，退火形成带缺口的双链；
所述两条单链序列分别为：
a：5’-CTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGATCCGCGGAATTCC-3’；SEQID NO.1；
b：5’-TCGAGGAATTCCGCGGATCCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTT-3’；SEQID NO.2；
(3)将步骤(2)合成的双链与步骤(1)双酶切的pET-32a原核表达载体连接，经转化、培养、测序，获得仅含单一his标签的原核表达载体pET-32a-gai。
3.根据权利要求2所述的一种原核表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)将两条单链序列95℃-60℃依次梯度退火，每个梯度5℃，每个梯度退火5min，形成一条有缺口的双链。
4.根据权利要求3所述的一种原核表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述连接为使用T4连接酶过夜连接。
5.根据权利要求4所述的一种原核表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述转化为用CaCl2法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。
6.权利要求1-5所述的原核表达载体在表达外源小分子蛋白中的应用。
7.根据权利要求6所述的原核表达载体在表达外源小分子蛋白中的应用，其特征在于，所述外源小分子蛋白为猪瘟病毒石门株衣壳蛋白C。
8.一种表达猪瘟病毒石门株衣壳蛋白C的方法，其特征在于，利用权利要求1-7所述的原核表达载体进行诱导表达，具体步骤如下：
(1)PCR扩增C蛋白的基因片段；
(2)将获得的基因片段与pET-32a-gai原核表达载体连接，获得pET-32a-gai-C原核表达载体；
(3)将pET-32a-gai-C导入宿主细胞，IPTG诱导表达得到带his标签的C蛋白。
9.根据权利要求8所述的一种表达猪瘟病毒石门株衣壳蛋白C的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
10.根据权利要求9所述的一种表达猪瘟病毒石门株衣壳蛋白C的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21。
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