[发明专利]泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合中性复合物纳米粒

说明书

一种泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的中性复合物纳米粒，涉及基因治疗领域，其包含泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质，包含PC或DSPC；本发明所提供复合物可用于体内外细胞的基因转染，可以将细胞外的基因递送至特定细胞内，使基因实现表达，既可以用于科研，尤其是指用于制备基因转染试剂盒或细胞标记试剂盒，还可以用于人的新药研发，尤其适用于mRNA肿瘤疫苗和mRNA流感病毒疫苗的开发。

技术领域

本发明涉及基因治疗领域，具体涉及一种用于核酸递送的泊洛沙姆和/或泊洛沙胺与脂质组合的中性复合物纳米粒，以及制备这种中性复合物纳米粒的方法，及其用于体内外细胞基因转染的用途，及其在疫苗新药领域的应用。

背景技术

基因治疗是指将外源治疗性基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。基因递送是通过递送技术将有生物活性的外源治疗性基因递送至病人的受体细胞中，并使外源治疗性基因翻译产生蛋白多肽从而治疗某种疾病。基因转染是一种将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能的技术。近年来，随着基因的体外合成技术、载体技术和编辑技术等生物技术的成熟，基因治疗时代已经正式来临。此前，美国FDA批准了Alnylam Pharmaceuticals公司的两款基于RNA干扰(RNAi)技术的基因治疗药物Onpattro和Gilvaari，它们分别用于治疗遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性(hereditary transthyretin amyloidosis hATTR)多发神经病变和急性肝卟啉症(AHP)，这在基因治疗领域的新药开发史上具有里程碑意义。然而在另一领域，随着如蛋白替代疗法、蛋白补充疗法、癌症和传染病的疫苗接种等更多关于mRNA应用场景的发现，人们开始着手克服mRNA的缺点如体内外稳定性、短半衰期和不利的免疫原性等，以挖掘其更多的功能。与DNA基因疗法相比，IVTmRNA疗法有自己的优势。IVTmRNA不需要进入细胞核就能发挥作用；相比之下，DNA疗法需要进入细胞核转录成RNA。这主要是由于mRNA是在细胞质起作用，不需要穿越难以逾越的细胞核膜，因此mRNA不会整合进入靶细胞的基因组，也就不存在插入诱变的风险。基于mRNA的疗法和药物开发引起了科学家与投资者的广泛兴趣。

DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的新型疫苗，是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第3代疫苗。DNA疫苗不仅有预防疾病的作用，同时还具有治疗疾病的作用。DNA疫苗是由插入一种或多种外源基因的质粒DNA和真核启动调控基因等元件构成的，载有外源抗原的质粒DNA在一种真核启动子和加尾信号以及相关增强子等基因单元的控制下，可在哺乳动物的各类细胞中表达出相关的抗原蛋白。将重组有外源抗原编码基因的质粒，利用某种基因递送方法导入人或动物的细胞内，通过宿主细胞的转录系统，在被免疫对象机体的活体细胞内合成抗原蛋白，从而诱导机体产生免疫应答。DNA疫苗具有以下优点：DNA接种载体(如质粒)的结构简单，提纯质粒DNA的工艺简便，因而生产成本较低，且适于大批量生产；DNA分子克隆比较容易，使得DNA疫苗能根据需要随时进行更新；DNA分子很稳定，可制成DNA疫苗冻干苗，使用时在盐溶液中可恢复原有活性，因而便于运输和保存；比传统疫苗安全，虽然DNA疫苗具有与弱毒疫苗相当的免疫原性，能激活细胞毒性T淋巴细胞而诱导细胞免疫，但由于DNA序列编码的仅是单一的一段病毒基因，基本没有毒性逆转的可能，因此不存在减毒疫苗毒力回升的危险，而且由于机体免疫系统中DNA疫苗的抗原相关表位比较稳定，因此DNA疫苗也不像弱毒疫苗或亚单位疫苗那样，会出现表位丢失的现象。质粒本身可作为佐剂，因此使用DNA疫苗不用加佐剂，既降低成本又方便使用；将多种质粒DNA简单混合，就可将生化特性类似的抗原(如来源于相同病原菌的不同菌株)或一种病原体的多种不同抗原结合在一起，组成多价疫苗，从而使一种DNA疫苗能够诱导产生针对多个抗原表位的免疫保护作用，使DNA疫苗生产的灵活性大大增加。但DNA疫苗存在以下严重的安全性问题：外源DNA进入机体后是否整合到宿主基因组，导致癌基因激活或抑癌基因失活；疫苗DNA长期在体内表达是否会诱导机体产生免疫耐受，长远来说，导致机体免疫功能低下；疫苗DNA作为一种外来物质，是否会引起机体产生抗DNA抗体；DNA疫苗诱导的CTL反应是否会对其他细胞产生杀伤作用。这些潜在的风险限制了DNA疫苗的广泛应用。