[发明专利]一种基于微流控和ELISA分析的外泌体分离检测系统

权利要求书

1.一种基于微流控和ELISA分析的外泌体分离检测系统，其特征在于，所述的外泌体分离检测系统包括微流控装置，所述的微流控装置包括微流控芯片，所述的微流控芯片包括顶部聚二甲基硅氧烷层和底部聚二甲基硅氧烷层，所述的底部聚二甲基硅氧烷层和顶部聚二甲基硅氧烷层之间粘合形成封闭的微通道；所述的底部聚二甲基硅氧烷层具有微流控图案，所述的微流控图案包括上样区、样品通道、分隔式微室和出样区，在所述的顶部聚二甲基硅氧烷层上安装有三个电极传感器：工作电极、计数电极和参比电极；

在所述的分隔式微室中加载有纳米磁珠-适体复合物，所述的纳米磁珠-适体复合物包含适体序列；所述的适体序列具有发夹结构，所述的适体序列为：5′λ-Fc-人工合成的核苷酸序列-biotin-3′；其中，所述的Fc为二茂铁，所述的biotin为生物素，所述的5′λ-Fc-人工合成的核苷酸序列-biotin-3′为5′λ -Fc- CACCCCACCTCGCTCCGTGACACTAATGCTACCAACCCC-biotin-3'，其中CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTACCAACCCC为序列1，序列1中包括序列2，序列2为与外泌体上抗原特异性结合的序列，所述序列2为CACCCCACCTCGCTCCGTGACACTAATGCTA；

所述的纳米磁珠-适体复合物的制备方法，包括以下步骤：将适体序列溶液30μl, 5μM添加到40μL、50μL、60μL、80μL、100μL、120μL浓度为100ng/mL的磁珠重悬液中，得到制备混合液；在20～40℃温度条件下，将所述的制备混合液孵育反应至少2小时；然后放置在磁力架上至少1min，去除上清液，随后用缓冲液B洗涤两次；在重复洗涤步骤两次之后，获得纳米磁珠-适体复合物；采用缓冲液C对所述的纳米磁珠-适体复合物进行重悬，然后加载至所述的分隔式微室里，所述的分隔式微室的下方设置有磁场发生装置，所述的缓冲液C的配方为：100 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，1 mM MgCl2，和5 mM KCl，缓冲液C pH = 7.4；

其中，所述的磁珠重悬液的制备方法为：先用500μL缓冲液A洗涤被链霉亲和素包被的磁珠量是3 ×10¹¹/mL的纳米磁珠，得到纳米磁珠处理液1；然后取50μL纳米磁珠处理液1，在其中加入50μL缓冲液A，得到纳米磁珠处理液2；将所述的纳米磁珠处理液2孵育15分钟后置于磁力架上，静置至少1min；去除上清液，用500μL缓冲液B将纳米磁珠沉淀洗涤两次，然后加500μL缓冲液B重悬，得到磁珠重悬液；缓冲液A的配方为100mM Tris-HCl、1mM EDTA和2MNaCl，缓冲液A pH 7.5；缓冲液B的配方为5 mM Tris-HCl、0.5 mM EDTA和100 mM NaCl,缓冲液B pH 7.5；

其中，所述的适体序列溶液的制备方法为：将适体序列溶于pH 7.4，1×PBS buffer中，得到适体序列溶液。

2.根据权利要求1所述的外泌体分离检测系统，其特征在于，所述的底部聚二甲基硅氧烷层和顶部聚二甲基硅氧烷层在构造上相互匹配。

3.根据权利要求1所述的外泌体分离检测系统，其特征在于，所述的微流控图案的制备方法包括：在80~120μm厚的Suλ硅片上对所述的上样区、样品通道、分隔式微室和出样区的图案同时进行光刻，得到光刻后的Suλ硅片；将液态聚二甲基硅氧烷直接倒在所述的光刻后的Suλ硅片上，然后在60~80℃条件下固化至少1小时，将固化的聚二甲基硅氧烷从所述的光刻后的Suλ硅片上剥离。

4.根据权利要求1所述的外泌体分离检测系统，其特征在于，所述的上样区是圆柱体结构，横截面是直径为1~2 mm的圆形，所述的上样区的高度是0.4~1mm；所述的样品通道是圆柱体结构，横截面为直径0.2~1mm的圆形，长度为20~30mm；所述的出样区是圆柱体结构，横截面是直径为0.6~1.2mm的圆形，高度是0.4~1mm；所述的分隔式微室是圆柱体结构，横截面是直径为1~1.6cm的圆形微孔板，高度是0.6~1mm；所述的圆形微孔板内均匀分布有直径1~2mm微孔。