[发明专利]一种从痰液中检测结核分枝杆菌的方法

说明书

本发明公开了一种从痰液中检测结核分枝杆菌的方法。本发明提供了一种试剂盒，其包括如下1)‑3)所示的物质：1)扩增含有6110‑crRNA靶序列的引物对；2)6110‑crRNA，其靶序列为序列3；3)LwCas13a蛋白，其氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成。本发明在CRISPR‑Cas13a检测技术的基础上，首次将PCR扩增技术和CRISPR‑Cas13a检测技术相结合，PCR技术因其技术稳定，实用性强，更适合应用于临床核酸检测；建立了一个新的高灵敏、高特异核酸检测方法。

技术领域

本发明属于诊断试剂领域，涉及结核病诊断试剂及试剂盒，具体涉及一种从痰液中检测结核分枝杆菌的方法。

背景技术

全球范围内，结核病仍是导致死亡的十大原因之一，据世界卫生组织(WorldHealth Organization,WHO)报道：2017年全球估计有1000万新发结核病患者，中国估计有88.9万新发患者。结核病疫情严重，对于结核病的诊治仍迫在眉睫。目前结核病细菌学诊断和免疫学诊断方面都面临很多问题，敏感性和特异性及检测的快捷方便和成本问题均不同程度存在问题。现阶段检测临床样本中的结核分枝杆菌诊断技术是临床上的综合诊断。目前结核病诊断的金标准为痰涂片阳性、分枝杆菌分离培养阳性、分子生物学检测阳性或者肺组织病理学检查阳性等。(一)、细菌学诊断：(1)涂片：抗酸染色敏感度低；(2)改良罗氏培养：时间长，需观察8周，敏感性不高；(3)BACTEC MGIT960快速培养系统：1-3周,仪器试剂昂贵；(二)分子生物学诊断：(1)XpertMtb/RIF检测:Mtb特异的实时PCR，是集标本处理、PCR、利福平耐药基因检测为一体的全自动快速检测方法，仪器试剂昂贵；(2)溶解曲线：用于诊断耐药结核病；(3)基因芯片技术：芯片的制备比较复杂，样本准备和标记又较为繁琐，检测成本高，需昂贵的特殊设备，难以常规开展；(4)线性探针技术：可同时检测INH和RFP耐药基因的突变，用于耐多药结核病；(5)环介导等温扩增技术(LAMP)：对结核分枝杆菌目的DNA片段进行检测从而诊断结核病；(6)同步恒温扩增技术：对结核分枝杆菌目的RNA片段进行检测从而诊断结核病。

目前的检测方法均存在有检测时间长、成本高、准确性和特异度低等问题，分子生物学诊断方法有其快速简便的特性，但目前的分子生物学方法仍然存在有敏感度不高，特异性低的问题。因此，研制出新型的快速便捷的核酸分子生物学诊断试剂极为迫切。

发明内容

本发明一个目的是提供一种试剂盒。

本发明提供的试剂盒，其包括如下1)-3)所示的物质：

1)扩增含有6110-crRNA靶序列的引物对；

2)6110-crRNA，其靶序列为序列3；

3)LwCas13a蛋白，其氨基酸序列如下a)-d)中任一种：

a)、氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；

b)将a)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

c)与a)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

d)a)-c)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的蛋白。

上述试剂盒还包括RNA聚合酶，还可以包括实施例表5所示体系中的其他组分。

本发明还提供了一个试剂盒，其包括如下A和B所示的物质：

A)扩增含有6110-crRNA靶序列的引物对；

B)含有6110-crRNA和LwCas13a蛋白的扩增体系；