[发明专利]一种重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法及应用

说明书

本发明涉及酶工程技术领域，具体公开了一种重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法及应用。所述重组聚氨酯塑料降解酶为重组PueA酶，所述制备方法包括：溶解包涵体：以含有SDS的Tris‑HCl缓冲液作为变性剂溶解所述重组PueA酶的包涵体得到包涵体蛋白溶解液；包涵体复性：向包涵体蛋白溶解液中加入KCl对所述包涵体蛋白溶解液进行复性，得到复性后的重组PueA酶。本发明还包括重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法在聚氨酯塑料降解处理中的应用。本发明步骤操作简单，避免了大体积缓冲液连续稀释复性，快速高效，大大降低实验成本；复性条件温和，有利于保持聚氨酯塑料降解酶活性；可应用于实验室研究以及工业化生产。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域。具体地说，涉及一种重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法及应用。

背景技术

聚氨酯(Polyurethane,PUR)，全称为聚氨基甲酸酯。1937年，Otto Bayer首次以石油化学品为原料合成了PUR，并于20世纪50年代开始工业化生产。由于具备良好的机械性能、热稳定性和耐久性，PUR塑料被广泛应用于保温建材、包装材料、汽车材料、合成革、鞋类材料、涂料、医用材料等。据统计，2016年全球PUR塑料年产量占合成塑料总产量的7.5％，达24.2Mt。伴随PUR塑料的广泛应用，不可避免会产生大量的废弃物。当前，PUR废塑料量已占到所有废塑料总体积的30％。传统的废塑料处理方法主要包括填埋、焚烧和回收。填埋在地下的废塑料数十年仍不能降解，不仅占用土地资源，还会产生有毒有害物质污染土壤和地下水；焚烧法虽能解决占用土地资源问题，还能通过回收热量用于发电或供暖，但存在不完全燃烧产生二噁英、一氧化碳和氮氧化物等有毒气体和烟尘等二次污染问题的风险；此外，由于PUR塑料种类繁多，使PUR废塑料的分类回收异常困难。若PUR废塑料未被合理处理，一旦被丢弃到自然环境中，就会对自然景观和生态系统造成严重的破坏和威胁。

通过生物处理方法处理废弃塑料，如利用塑料降解酶分解聚合物，同时生成聚合物单体，进一步回收利用，是一种资源节约、环境友好的处理方法。2000年，Stern和Howard从细菌Pseudomonas chlororaphis克隆到一个脂肪酶基因PueA(AF069748.1)，所编码的酶具有降解聚酯聚氨酯的作用(FEMS Microbiology Letters 2000,185:163-168)。不过，由于PueA基因在大肠杆菌中重组过表达时，蛋白容易错误折叠而聚集形成不可溶的包涵体，使得活性蛋白酶的产率极低，阻碍了PueA基因编码的酶在塑料生物降解处理技术之中的应用。自PueA基因被克隆时起，至今没有任何关于通过处理包涵体制备PueA重组酶的方法的报道。

传统的包涵体变性复性方法，多采用尿素、盐酸胍和十二烷基硫酸钠(SDS,CAS151-21-3)等强变性剂先使包涵体变性，然后再通过连续稀释的方法降低变性剂的浓度，使蛋白复性。这些方法在复性过程中，均需要大体积缓冲液稀释降低变性剂浓度，以使蛋白质复性，导致复性过程耗材耗时耗力，复性蛋白浓度低等缺点。目前为止，还没有很好的办法来替代大体积缓冲液稀释的复性方法。

因此，需要提供一种新的重组聚氨酯塑料降解酶制备方法以解决上述问题。

发明内容

针对目前聚氨酯塑料降解酶基因在大肠杆菌中重组表达将形成无活性包涵体，且缺乏基因重组表达聚氨酯塑料降解酶包涵体的高效变性复性方法的问题，本发明的目的在于提供一种变性方法温和，复性过程简便、效率高的重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种重组聚氨酯塑料降解酶-重组PueA酶的制备方法在聚氨酯塑料降解处理中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

一种重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法，所述重组聚氨酯塑料降解酶为重组PueA酶，所述制备方法包括：

溶解包涵体：以含有SDS的Tris-HCl缓冲液作为变性剂溶解所述重组PueA酶的包涵体得到包涵体蛋白溶解液；