[发明专利]一种弓形虫双基因缺失虫株及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种弓形虫双基因缺失虫株的构建方法，包括如下步骤：抑制或沉默弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的表达，得到所述弓形虫双基因缺失虫株；

所述DNA损伤诱导蛋白1基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；

所述紫外剪切修复蛋白23基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制或沉默弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的表达为敲除弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述敲除弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因为将弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因均替换为抗性基因。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述将弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因均替换为抗性基因的方法为基于CRISPR/Cas9介导的同源重组技术。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

1)将含有抗性基因甲的同源重组片段和靶向DNA损伤诱导蛋白1基因的CAS9质粒导入弓形虫虫株中，使所述弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因替换为抗性基因甲，经过筛选和鉴定，得到缺失DNA损伤诱导蛋白1基因的弓形虫虫株；

所述含有抗性基因甲的同源重组片段依次包括DNA损伤诱导蛋白1基因上游同源臂、抗性基因甲和DNA损伤诱导蛋白1基因下游同源臂；

2)将含有抗性基因乙的同源重组片段和靶向紫外剪切修复蛋白23基因的CAS9质粒导入所述缺失DNA损伤诱导蛋白1基因的弓形虫虫株中，使所述缺失DNA损伤诱导蛋白1基因的弓形虫虫株中的紫外剪切修复蛋白23基因替换为抗性基因乙，经过筛选和鉴定，得到缺失DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的弓形虫虫株；

所述含有抗性基因乙的同源重组片段依次包括紫外剪切修复蛋白23基因上游同源臂、抗性基因乙和紫外剪切修复蛋白23基因下游同源臂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述1)中，所述抗性基因甲为氯霉素抗性基因；

所述含有抗性基因甲的同源重组片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示；

所述靶向DNA损伤诱导蛋白1基因的CAS9质粒为pSAG1-CAS9-U6gRNA(ddi1)；

所述2)中，所述抗性基因乙为乙胺嘧啶抗性基因；

所述含有抗性基因乙的同源重组片段的核苷酸序列如序列表中序列4所示；

所述靶向紫外剪切修复蛋白23基因的CAS9质粒为pSAG1-CAS9-U6gRNA(rad23)。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述弓形虫虫株为具有DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的弓形虫虫株；

或，所述弓形虫虫株具体为弓形虫RH虫株或弓形虫RHΔKu80虫株。

8.按照权利要求1-7任一所述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株。

9.如下a1)-a4)中任一所述的应用：

a1)按照权利要求1-7任一所述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株在作为弓形虫疫苗或弓形虫弱毒疫苗或弓形虫弱毒活疫苗中的应用；

a2)按照权利要求1-7任一所述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株在制备弓形虫疫苗或弓形虫弱毒疫苗或弓形虫弱毒活疫苗中的应用；

a3)按照权利要求1-7任一所述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株在制备预防和/或抵抗弓形虫感染的产品中的应用；

a4)按照权利要求1-7任一所述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株在制备预防和/或治疗弓形虫病的产品中的应用。

10.如下b1)-b5)中任一种产品，其活性成分为按照权利要求1-7任一所述方法构建得到的弓形虫双基因缺失虫株；

b1)弓形虫疫苗；

b2)弓形虫弱毒疫苗；

b3)弓形虫弱毒活疫苗；

b4)预防和/或抵抗弓形虫感染的产品；

b5)预防和/或治疗弓形虫病的产品。