[发明专利]一种精氨酸衍生物Bz-Arg-AMC的合成方法及应用

说明书

本发明申请提供一种精氨酸衍生物Bz‑Arg‑AMC的合成方法及其应用。该方法以7‑氨基‑4‑甲基香豆素(简称AMC)为起始原料，经Fmoc‑Arg(pbf)‑OH缩合、脱保护、苯甲酰化获得目标物，用于降纤酶含量测定，比肉眼观察的纤维蛋白原凝固法准确、特异、简单、快速，因此发色底物荧光法比现有降纤酶国家药品标准(WS1‑XG‑031‑2000)中采用的纤维蛋白原凝固法重现性更好，更适合本品低含量效价测定。

技术领域

本发明为多肽合成制备及应用领域，特别是精氨酸衍生物Bz-Arg-AMC的合成方法和应用。

背景技术

食品安全问题受到人们的日益关注，已经在全世界范围内引起高度重视。而食源性致病菌是引起食源性疾病的重要原因，是食品安全的重大隐患。近年来由食源性致病菌引发的疾病呈上升趋势。如大肠杆菌O157：H7引起了近万人中毒。因此对致病菌进行快速有效的检测就显得尤为重要。传统的检测方法(如分离培养、生化鉴定等)对致病菌的检测特异性不高、灵敏度低、操作繁琐耗时，不能实现快速检测。近年来，特异性酶底物合成和应用发展迅速，已经广泛应用于微生物检测。该方法是将荧光底物或显色底物加入到培养基中，微生物代谢过程中产生的特异性酶将底物分解，释放出色原(直接显色)或荧光团(需在紫外灯下照射显色)，从而实现对微生物的检测和鉴定。尽管特异性显色酶底物法具有操作简便、灵敏性高、特异性好、检测时间短等优点，但是要将该方法作为日常检测方法成本较高，主要是因为现有荧光底物和显色底物的合成工艺复杂、产率低、价格昂贵。因此迫切需要开发出简单易行的合成工艺，降低酶底物的生产成本。近年来通过对常见食源性致病菌显色培养基及其显色底物进行深入研究，目前已成功制备出显色底物磷脂酰基醇(PI)用于检测单核细胞增生性李斯特菌，与进口产品效果相当，明显降低了检测成本。目前国内外应用的荧光底物主要是4-甲基伞形酮和7-氨基-4-甲基香豆素的各类衍生物，包括糖苷类、酯(脂)类、肽类等。4-甲基伞形酮主要用于检测酯(脂)水解酶、糖苷酶等，7-氨基-4-甲基香豆素用与检测肽酶或蛋白酶。

7-氨基-4-甲基香豆素(简称AMC)是重要的荧光物质。因为7位的氨基存在，易与肽链末端羧基缩合形成多肽-香豆素类荧光底物，已成功地应用于微生物检测、免疫检测、生化酶学和多肽合成等研究领域。

发色底物又称发色性多肽底物,显色多肽、产色基质,是一类带有发色基团的小肽,系人工合成的可以代替天然大分子蛋白的底物。1961年,Erlanger等首先用发色性底物苯甲酰-精氨酸-对硝基苯胺(BAPNA)检测丝氨酸蛋白酶。但因该底物未全面照顾到酶与底物相互作用的切点,故专一性和灵敏度欠佳。文献报道采用精氨酸酯酶裂解甲基苯磺酰胺-L-精氨酸甲酯(TAME)，其裂解产物甲基苯磺酰胺-L-精氨酸在247nm波长下有吸收,通过UV法可测得降纤酶的活性。但底物灵敏度不高，在降纤酶浓度为5u/mL时已无法测出。

降纤酶是一种典型的类凝血酶,是以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶,能高选择性的作用于血纤蛋白原,但其对血纤蛋白原的作用比凝血酶更为专一。

现行质量标准采用纤维蛋白原凝固法测定注射用降纤酶含量，该方法的灵敏度虽然高，但存在缓冲液离子浓度、辅料严重影响注射用降纤酶的效价测定，不利于中间体和成品质量控制。如将缓冲溶液稀释一倍，效价结果偏高约一倍左右。辅料右旋糖酐对成品测定也产生干扰，导致结果严重偏离。其次肉眼观察终点误差大，需要探索新的检测方法进行质量控制。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提出一种精氨酸衍生物Bz-Arg-AMC的合成方法及应用。具体技术方案如下：

本发明Bz-Arg-AMC的结构式如下：

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案实现。本发明是一种Bz-Arg-AMC的合成方法，其特点是：包括如下步骤：

步骤A：由AMC、Fmoc-Arg(pbf)-OH缩合反应得到Fmoc-Arg(pbf)-AMC