[发明专利]一种滋养细胞、其制备方法及其在高效扩增NK细胞中的应用

权利要求书

1.一种pLenti-mbIL21-4 .1BBL-CD16A-OX40L质粒载体，其特征在于，包括如SEQIDNO:5所示的整个载体连续编码区序列IL21-F2A-4 .1BBL-E2A-CD16A-P2A-OX40L-T2A。

2.一种权利要求1所述的pLenti-mbIL21-4 .1BBL-CD16A-OX40L质粒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

 S11，利用基因合成的方法合成E2A-CD16A-P2A-OX40L-T2A-puro基因的全长编码区序列；

S12，将CD16A-P2A-OX40L基因构建到慢病毒质粒载体pLenti-mbIL21-4.1BBL载体上，形成pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L质粒载体。

3.一种K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S31，将1-2million的旺盛生长的K562细胞放入24孔板中的一个孔进行培养，培养基为1-2毫升含有10％wtFBS的1640培养基；

S32，再将30-35毫升病毒上清液超速离心浓缩的300μL慢病毒颗粒加入孔中，培养5-6天后，再用1-4μg/ml的Puromycin进行选择性培养，所述慢病毒颗粒包含权利要求1所述的pLenti-mbIL21-4 .1BBL-CD16A-OX40L质粒载体；

S33，用流式检测K562-mbIL21-4 .1BBL-CD16A-OX40L的4个基因在K562细胞的表达，使各个基因的表达在80％以上；

S34，再用100Gy的γ射线照射10分钟，-80℃冰箱进行冻存。

4.一种K562-mbIL21-4 .1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞，其特征在于，所述滋养细胞是通过权利要求3所述的方法制备得到的。

5.一种NK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的质粒载体包装慢病毒颗粒后，再将所述慢病毒颗粒侵染滋养细胞系，获得能够表达目的基因的滋养细胞，再利用滋养细胞在体外大量扩增NK细胞，得到高质量的NK细胞。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述目的基因包括IL21、4 .1BBL、CD16A和OX40L中的至少一种；所述滋养细胞系包括肿瘤细胞。

7.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，pLenti-mbIL21-4 .1BBL-CD16A-OX40L质粒载体的构建；

S2，用pLenti-mbIL21-4 .1BBL-CD16A-OX40L质粒载体包装慢病毒颗粒；

S3，K562-mbIL21-4 .1BBL-CD16A-OX40L滋养细胞的制备；

S4，脐血或外周血白膜层细胞的制备；

S5，NK细胞的体外扩增。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S2具体包括：

S21，重组慢病毒的包装制备；

S22，重组慢病毒的超速离心浓缩。