[发明专利]从蟾酥中分离得到的肿瘤细胞亲和肽及其筛选方法

说明书

本发明公开了从蟾酥中分离得到的肿瘤细胞亲和肽及其筛选方法。本发明通过蟾酥多肽与肿瘤细胞体外连续亲和作用以及多肽荧光标记法筛选出蟾酥中的肿瘤细胞亲和肽。通过Nano‑LC‑MS/MS法检测与肿瘤细胞生物亲和前后蟾酥多肽组分，发现蟾酥多肽亲和前后总离子流图发生显著改变。以转录组从头测序构建的蛋白序列库为模板，对质谱原始数据进行数据库检索，获得18条高亲和力肿瘤亲和肽。采用多肽荧光标记法定位方法，证明这些蟾酥亲和肽能够进入肿瘤细胞内，分散于细胞质内或聚集于细胞核、线粒体等细胞器。本发现筛选得到的多肽可用于制备治疗肿瘤疾病的药物或者作为靶向给药递送系统及肿瘤成像的新材料。

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体涉及蟾酥药材中的肿瘤细胞亲和肽。

背景技术

随着发病率和死亡率的逐年攀升，恶性肿瘤目前成为威胁人类健康的重大疾病，对于恶性肿瘤的高效治疗已成为医学领域的研究热点。手术切除联合细胞毒类化疗药物/抗体等蛋白类药物虽然在一定程度上降低癌症死亡率，但现有的化疗药物选择性低、毒副作用大，容易产生耐药性；免疫抗体复合物则体积较大，很难渗透进入肿瘤组织。与传统的药物相比，多肽具有特异性强、高度靶向专一性和选择性、毒副作用低、易于吸收、生物利用度高、不易产生耐药性以及易于修饰等特点，在抗肿瘤的实验研究及临床应用中得到广泛关注。特异性靶向多肽既可用于探测肿瘤细胞表型特征，又可将其与抗癌药物结合进行靶向治疗，同时还可作为体内肿瘤的成像制剂，用于肿瘤及肿瘤细胞微转移的早期探测。

噬菌体展示技术(生物淘选)是筛选肿瘤或癌细胞的靶向肽的一种手段。例如，从噬菌体展示肽库筛选获得LyP-1，能与肿瘤及肿瘤淋巴管内皮细胞结合，并穿透进入移植瘤内部，作为靶向制剂及造影剂在肿瘤治疗及检测中发挥作用。然而噬菌体展示技术有其固有弊端。大多数噬菌体展示肽库都是人工随机化学合成，不能对天然多肽样本进行筛选；就化学合成而论，其短肽序列与生物源序列匹配的概率在静态上是较低的，尤其缺乏有效的肽修饰(PTMs)。因此，开展基于天然肽库的筛选，对于发现天然肿瘤靶向多肽非常重要。

蟾酥是我国传统的名贵中药之一，为蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufo bufogargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)的耳后腺及皮肤分泌的白色浆液,经干燥而成。具清热解毒，消痈止痛，开窍醒神的功效。现代药理学研究表明，蟾酥具有显著抗肿瘤作用，以蟾酥或蟾皮为原料的多种制剂(华蟾素注射液、蟾酥注射液、得力生注射液、安替可胶囊等)广泛用于淋巴癌、肝癌、胃癌、肺癌等的临床治疗。多个临床对照实验研究显示，蟾酥相关水溶性制剂在抑制肿瘤复发、延长癌症患者生存期、提高患者生存质量方面具有明显优势。而经水提工艺制备的制剂中，脂溶性组分蟾蜍甾烯含量较少，而水溶性大分子多肽含量非常高。表明蟾酥多肽是蟾酥抗肿瘤药效的一类关键效应物质。动物药蟾酥含有的种类丰富的多肽类物质，构成一种天然的多肽库，而当前从蟾酥中鉴定肿瘤靶向肽的研究极为缺乏。

因此，本发明基于多肽独特氨基酸序列和两亲性及跨膜性质，通过蟾酥天然多肽组与肝癌细胞(SMMC-7721)相互作用建立连续亲和筛选模型，采用液相-质谱(Nano-LC-MS/MS)法检测与肿瘤细胞生物亲和前后蟾酥多肽组分，结合实验室转录组测序构建的蛋白组序列自建库，对蟾酥中的肿瘤亲和多肽类物质进行鉴定，并采用多肽荧光标记法定位方法进一步验证蟾酥多肽的肿瘤亲和作用。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供从蟾酥中分离得到的肿瘤细胞亲和肽，所述的亲和肽序列为：