[发明专利]一株致病性海洋哈氏弧菌及其应用

说明书

本发明提供一种哈氏弧菌，为哈氏弧菌ML01菌株，保藏编号为CGMCC No.11720。本发明所提供的哈氏弧菌ML01菌株可以用于制备高保护性的、水产养殖用哈氏弧菌灭活疫苗。使用本发明的菌株及其制备的疫苗，可有效防治海水养殖鱼类哈氏弧菌病，降低发病率和死亡率，减少养殖生产中抗生素的使用量，提高经济效益并保护生态环境。

技术领域

本发明属于水产养殖病害微生物筛选和应用技术领域，具体涉及一株致病性海洋哈氏弧菌菌株及其在灭活疫苗制备方面的应用。

背景技术

我国水产养殖业随着技术手段的进步逐步向集约化、高密度、工厂化的方向发展。在这样的背景下，养殖水环境条件的恶化、水产养殖动物种质的下降、水产品贸易的全球化等问题更加加剧了渔业病害的流行和爆发，每年导致我国的渔业生产出现巨大损失。在水产养殖病害中，细菌性病原和病毒性病原所导致的传染性疾病占病害的绝大多数，因此对于细菌性和病毒性传染病的防治一直是研究的热点。

哈氏弧菌(Vibrio harveyi)是一种革兰氏阴性杆菌，菌体呈弧状，极生单鞭毛，广泛分布于海洋环境中。近年来，哈氏弧菌已成为水产养殖动物的重要致病菌，造成了中国对虾、罗氏沼虾、斑节对虾、大黄鱼、石斑鱼、花鲈、大菱鲆等多种水产养殖动物的发病和死亡，并造成了巨大的经济损失。

对于鱼类细菌性病害，传统防治方法是采用抗生素等药物对病原进行杀灭，这一方法价格低廉，易于操作。但是所带来的抗生素等药物残留以及致病菌耐药性增加等水产品安全问题也日益暴露，引起极大重视。疫苗具有环境友好、效果显著、经济实用等优点，是控制水产动物细菌性疾病的重要手段之一，在世界上得到了广泛的应用。通常，从发病动物体内分离到的细菌强毒株，在开发细菌疫苗方面价值最大。在抗生素被严格限制用于食品动物的大环境下，分离、筛选感染水产动物的哈氏弧菌并研制其疫苗，对控制水产动物哈氏弧菌病、发展绿色水产养殖具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种哈氏弧菌及其在灭活疫苗制备方面的应用，该菌株可用于不同类型疫苗的制备及其免疫技术的应用。

本发明提供一种哈氏弧菌(Vibrio harveyi)ML01菌株，分离、筛选自山东某海水养殖场发病的珍珠龙胆石斑鱼体内。该菌株已交由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.11720；保藏日期为2015年11月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明所提供的哈氏弧菌ML01菌株，其独特性首先表现在毒力方面，该菌株是一种具有较强毒力的哈氏弧菌菌株；通过腹腔注射感染，该菌株对珍珠龙胆石斑鱼的半数致死量(LD₅₀)为1.10×10⁶CFU/mL，对牙鲆的LD₅₀为4.64×10⁶CFU/mL。

用2.76×10¹CFU/mL的浓度对珍珠龙胆石斑鱼创伤感染，在自然条件下，该菌株的致死率高达90％。

本发明所提供的哈氏弧菌ML01菌株，在生化特性、基因序列和免疫效果等方面与已发现的哈氏弧菌相比具有独特性。API-32E鉴定系统显示，其生理生化指标与菌种库收录的菌株生化谱均不同；免疫效果分析显示，由该菌株制备的灭活疫苗，对牙鲆具有明显免疫保护作用。

本发明所提供的菌株，于可以用于制备高保护性的、水产养殖用哈氏弧菌灭活疫苗。

将哈氏弧菌ML01菌株纯培养，离心收集菌体并用PBS洗涤3次，用平板涂布计数法确定菌浓度后，按0.3％的体积比加入福尔马林并置于4℃灭活48h。离心收集灭活后的菌体并用PBS洗涤3次，用PBS调整至1.0×10⁹CFU/mL，即为哈氏弧菌全菌灭活疫苗。