[发明专利]一种固定化全细胞及其制备方法与在产3-氨基丙酸中的应用

说明书

本发明公开了一种固定化全细胞及其制备方法与在产3‑氨基丙酸中的应用，固定化全细胞的制备方法包括如下步骤：(1)将L‑天冬氨酸脱羧酶菌株培养，离心，得到菌体；(2)用水将步骤(1)得到的菌体重悬，得到细胞重悬液；(3)将步骤(2)得到的细胞重悬液与离子溶液混合，再加入配体溶液，搅拌，洗涤，将洗涤后的固体部分沉淀，所得沉淀物即为固定化全细胞。与现有技术相比，本发明通过固定化全细胞的方法，提高了细胞的在催化体系中的催化活性、耐受性和重复利用率。

技术领域

本发明属于全细胞催化和微生物固定化领域，具体涉及一种固定化全细胞及其制备方法与在产3-氨基丙酸中的应用。

背景技术

3-氨基丙酸，又称为β-丙氨酸，是唯一的一种天然β型氨基酸，在生物体中有着很重要的生理功能，并且是泛酸合成过程中不可或缺的媒介。3-氨基丙酸作为最具潜力的三碳化合物之一，被广泛的应用于医药、建筑、食品等多个领域。当前，化学合成3-氨基丙酸过程中存在的反应条件苛刻、污染严重、转化率低等问题，使得生物酶法合成3-氨基丙酸受到广泛的关注。以L-天冬氨酸作为底物，用全细胞催化的方式来合成3-氨基丙酸是一个较为明智的选择，它具有很多优势，如高稳定性、节约成本及节省时间等。然而，全细胞催化的方式存在酶活性低、存在底物产物抑制、耐受性差等问题限制其在3-氨基丙酸生物合成中的应用。

金属-有机框架材料是金属离子或金属簇与有机配体组成的，具有一定尺寸和多孔结构的纳米材料。金属-有机框架材料具有超高的比表面积、高的孔隙率、容易修饰的特点和较高的热稳定性，在催化、物质吸附、离子交换、气体储存等方面展现出广阔的应用价值。通过将金属-有机框架材料附着于微生物表面，对微生物进行固定化和功能化，可以提高微生物在生物催化过程中的稳定性、耐受性、可控性和催化活性。因此本研究基于固定化微生物的角度，以金属-有机框架材料固定化大肠杆菌进而大肠杆菌在生物催化过程中的催化活性和耐受性，进而提高大肠杆菌生物催化产3-氨基丙酸的产量。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，大肠杆菌在生物催化产3-氨基丙酸过程中产量低和菌体耐受性低的问题，提供一种固定化全细胞制备3-氨基丙酸的方法，该方法对于3-氨基丙酸的产量有了明显的提升，并且显著提升了生物催化过程中的菌体耐受性。

发明思路：利用金属-有机框架材料与微生物共沉淀法制备出金属-有机框架材料固定化全细胞，利用不同金属离子对于细胞中承担催化作用的酶的促进和激活作用，提升微生物细胞的催化活性，利用形成的金属-有机框架材料对细胞进行保护作用，提升微生物细胞在生物催化过程中的耐受性和重复利用率，进而提升3-氨基丙酸的产量。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种固定化全细胞的制备方法，其包括如下步骤：

(1)将L-天冬氨酸脱羧酶菌株培养，离心，得到菌体；

(2)用水将步骤(1)得到的菌体重悬，得到细胞重悬液；

(3)将步骤(2)得到的细胞重悬液与离子溶液混合，再加入配体溶液，搅拌，洗涤，将洗涤后的固体部分沉淀，所得沉淀物即为固定化全细胞。

步骤(1)中，构建L-天冬氨酸脱羧酶菌株的方法包括如下步骤：

(i)提取谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13032、大肠杆菌MG1655及B.subtilis中的基因组，以这三种基因组为模板，PCR扩增ADC基因panD，得到PCR产物；

(ii)将步骤(i)得到的PCR产物经琼脂糖回收，用Nco I、Xho I双酶切；

(iii)将pET28a载体载体进行双酶切；

(iv)用T4 DNA连接酶将步骤(ii)得到的目的片段连接到酶切后的载体上，得到重组质粒pET28a-panDC.g；