[发明专利]一种与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性SSR标记及其应用

说明书

本发明公开了一种与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性SSR标记及其应用，所述的与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM22038、TM23004和TM22041，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。所述的应用为所述的与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在纯合基因型nic1而具有低尼古丁含量烟草品种中的应用。本发明所述的共显性SSR标记具有稳定、可靠、简便、快捷和低成本的特点，因此该分子标记可以作为烟草品质育种中低尼古丁含量基因nic1分子标记辅助选择的应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与烟草尼古丁合成主效调控基因nic1紧密连锁的共显性SSR标记及其应用。

背景技术

烟草（Nicotiana tabacumL.）是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。尼古丁是栽培烟草重要的特征化合物，占烟草总生物碱的95%左右，而其在烟叶中的含量直接决定烟草品质和商业用途，受各国食品药品相关政府管理机构的政策性导向极强，故此，各大烟草公司及研究机构已开始积极培育低尼古丁含量的烟草品种，开发低尼古丁含量烟草制品。国内外烟草公司和研究机构正致力于鉴定尼古丁合成的主效调控基因NIC1，希望通过利用该基因调节烟叶中的尼古丁含量，实现减少烟草制品中的尼古丁含量而达到降低对人体的危害性的目的。此外，国内外大量研究机构正在利用生物技术手段开展调节烟草烟碱含量进而实现提高烟草品质的研究，一方面积极应对新型烟草制品对高品质原料的商业迫切需求，另一方面也为有效降低电子烟等新型烟草产品的烟碱含量而达到减轻对人体健康的危害性。

通过对4份具有尼古丁合成主效调控基因突变的白肋烟近等基因系材料HABurley 21（NIC1NIC1NIC2NIC2）、HIBurley 21（NIC1NIC1nic2nic2）、LI Burley 21（nic1nic1NIC2NIC2）和LABurley 21（nic1nic1nic2nic2）的遗传学研究发现，烟草中尼古丁的生物合成分别受到两个完全显性且独立遗传的基因（NIC1和NIC2）调控，其中NIC1基因对尼古丁合成的调控能力是NIC2基因的2.4倍，即，NIC1是烟草尼古丁合成的主效调控基因（Legg, P.D., Chaplin, J.F., Collins, G.B., 1969. Inheritance of percenttotalalkaloids inNicotiana tabacum L.: populations derived from crosses oflow alkaloid lineswithburley and flue-cured varieties. J. Hered. 60, 213-217;Legg, P.D., Collins, G.B., 1971. Inheritance of per cent total alkaloids inNicotianatabacum L.: II.Genetic effects of two loci in Burley 21 x LA Burley21populations. Can. J. Genet. Cytol. 13, 287-291.）。基于已公开的烟草基因组数据并结合生物信息学和生物技术实验证明，烟草中调控尼古丁合成的NIC2基因是至少由7个ERF（Ethylene Response Factor）位点组成，如NtERF189，NtERF179等 （Shoji, T.,Kajikawa, M., Hashimoto, T., 2010. Clusteredtranscription factor genesregulate nicotine biosynthesis in tobacco. Plant Cell 22, 3390-3409; Shoji,T., Hashimoto, T., 2012. DNA-binding andtranscriptional activation propertiesof tobacco NIC2-locus ERF189 and related transcription factors.PlantBiotechnology 29, 35-42.）。Burley 21 LA品系中的nic2基因突变是由于NIC2基因所在的染色体片段丢失所造成的（Kajikawa M., SierroN., Kawaguchi H., et al., 2017.Genomic insights into the evolutionof the nicotine biosynthesis pathway intobacco, Plant Physiology 174, 999-1011.）。近年来，随着基因组和测序技术的发展，ERF类转录因子对烟碱合成调控的分子机理也逐渐清晰。根据相关报道，烟草ERF转录因子家族中IX亚族中的ERF（NIC2）转录因子通过直接结合烟碱合成途径中关键代谢限速酶基因（如NtPMT、NtQPT）启动子中的GCC-box转录激活该基因的表达，进而增强烟碱的合成与积累（De Boer K., TillemanS., Pauwels L., et al., 2011.APETALA2/ETHYLENERESPONSEFACTOR and basic helix-loop-helix tobacco transcription factorscooperativelymediate jasmonate-elicitednicotine biosynthesis, Plant J. 66,1053-1065; Shoji T., Hashimoto T., 2012. DNA-binding and transcriptionalactivation propertiesoftobacco NIC2-locus ERF189 and related transcriptionfactors, Plant Biotechnology29, 35- 42; Xu B., TimkoM.P., 2014. Methyljasmonate induced expression of the tobacco putrescine N-methyltransferasegenes requires both G-box and GCC-motifelements, Plant Mol.Biol. 55, 743-761.）。近期，国内外学者分别在烤烟（云烟87）和白肋烟（HABurely 21）基因组中发现了一个新的NIC2-likeERF基因，其组成与NIC2基因高度类似，但对烟草尼古丁调控的积累尚未报道（Kajikawa M., Sierro N., Kawaguchi H., et al., 2017.Genomic insightsinto the evolutionof the nicotine biosynthesis pathway intobacco, Plant Physiology 174, 999-1011; Sui X., Zhang H., Song Z.2019.Ethylene response factor NtERF91 positively regulates alkaloidaccumulationsin tobacco (Nicotiana tabacumL.), Biochem Biophys Res Commun. 517(1):164-171.）。此外，有研究进一步表明，上述NIC2-like基因就是NIC1基因位点，并开发出多个用于检测白肋烟NIC1基因的SNP（Single Nucleotide Polymorphism）分子标记，且将检测的标记及方法申请了专利（PCT/US2018/038679）。