[发明专利]rhTSG-6在鸡胚-H2N9亚型禽流感病毒血凝体系上抗病毒活性的检测方法与应用

说明书

本发明提供了rhTSG‑6在鸡胚‑H2N9亚型禽流感病毒血凝体系上抗病毒活性的检测方法与应用，该方法对观察与检测rhTSG‑6抗病毒活性结果显示，其可抑制鸡胚尿囊中H2N9亚型禽流感病毒的增殖复制，发生了血凝现象降低或全无现象。以此为评价结果的标准，可使不同批次测定的rhTSG‑6蛋白效价检测结果更为可靠可信；该方法结果明确，重复性及准确度均高；经本方法验证，rhTSG‑6抗H2N9亚型禽流感病毒的效价高达100000.00U/mL以上。填补了相关领域空白。

技术领域

本发明属于微生物学与免疫学领域，具体涉及rhTSG-6在鸡胚-H2N9亚型禽流感病毒血凝体系上抗病毒活性的检测方法与应用。

背景技术

肿瘤坏死因子α刺激基因6(tumor necrosis factor-α stimulated gene 6，TSG-6)是一种炎症相关的分泌性蛋白。大量研究表明，TSG-6是一种效果明显的抗炎因子，在肝炎、关节炎、视网膜炎、组织损伤、瘢痕疙瘩等炎症过程中，TSG-6均能够抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的表达，并且具有抑制中性粒细胞浸润等功能，发挥较强的抗炎作用。在机体遭受感染、创伤等侵害时，适度的炎症反应会有利于机体清除病原体，修复损伤。虽然TSG-6的研究及其生物学功能得到日益重视，但至今尚未见到该重组蛋白在鸡胚-H2N9亚型禽流感病毒血凝试验模型体系上检测其具有抗病毒活性等报告。本发明首次发现，重组人TSG-6(recombinant human TSG-6，rhTSG-6)在体内外均具有抗病毒活性，填补了此领域的空白。

发明内容

本发明公开了rhTSG-6在鸡胚-H2N9亚型禽流感病毒血凝体系上抗病毒活性的检测方法与应用，H9N2亚型禽流感病毒主要通过其表面的血凝素蛋白感染宿主易感细胞；而血凝素蛋白可以与脊椎动物红细胞表面的唾液酸受体结合，从而使红细胞之间发生凝集，此现象称为血凝反应(hemagglutination assay，HA)。当与一定量的特异性抗体与病毒预先处理后，病毒表面的血凝素蛋白被特异的抗体封闭，便失去HA活性，此种现象称之为血凝抑制(hemagglutination inhibition assay，HI)现象。

依据此原理，本发明发现，rhTSG-6在鸡胚-H2N9亚型禽流感病毒血凝体系上具有与特异性抗体类似的抗病毒活性现象，即能抑制H9N2亚型禽流感病毒在鸡胚尿囊中的复制增殖。此活性可以一定量的rhTSG-6能使H9N2亚型禽流感病毒血凝现象被抑制的程度(半数抑制或全抑制)作为检测其活性的结果，即以每毫升rhTSG-6检品的最高稀释度仍能保护半数鸡胚(50％)免受病毒的攻击使之出现HI现象的稀释度的倒数定为rhTSG-6单位(或称效价)，常以单位(U)表示。该结果经HI现象观察后，按Reed-Muench公式计算出所测rhTSG-6抗病毒活性的效价，约为1.0×10³U～1.0×10⁵U/mL/mL；通过Spss16.0对各组鸡胚尿囊液中被抑制病毒增殖的数据进行统计分析，结果如图5所示。从图5中可以看出，相比病毒对照组和阴性对照组，rhTSG-6各组的HA效价有明显下降，随着rhTSG-6浓度下降，HA效价下降幅度随之降低，则判断rhTSG-6具有明显抗病毒效果，同时低剂量组、中剂量、较高剂量和高剂量组均表现出非常显著的抑制病毒增殖效力(p0.01)。该方法能准确客观地观察与检测rhTSG-6抗病毒活性，填补了相关领域空白。

本发明采取的技术方案为：

本发明提供了重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6在抗H9N2亚型禽流感病毒药物中的应用。通过鸡胚/H9N2亚型禽流感病毒血凝体系，rhTSG-6能有效抑制H9N2亚型禽流感病毒在鸡胚中的增殖，可明显降低鸡胚尿囊液中H9N2病毒的血凝效价。验证了rhTSG-6具有抗病毒的作用。

本法还提供了一种检测重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6抗病毒活性的血凝抑制体系，所述血凝抑制体系为重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6/鸡胚/H9N2亚型禽流感病毒血凝抑制体系。