[发明专利]黄酮-O-甲基转移酶及其在汉黄芩素、异汉黄芩素和苏荠苧黄酮合成中的应用

说明书

本发明提供了一种黄酮‑O‑甲基转移酶，其包括如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示氨基酸序列的黄酮‑8‑甲基转移酶以及如SEQ ID No.6、SEQ ID No.7所示氨基酸序列的黄酮‑7‑甲基转移酶中的一种或多种，并提供了编码该氨基酸序列的核苷酸序列、以及含有编码上述氨基酸的多核苷酸序列的重组载体、重组宿主细胞及其应用。本发明中上述黄酮‑O‑甲基转移酶能够用于黄酮如汉黄芩素、异汉黄芩素和苏荠苧黄酮等的合成以及，能够催化具有相似结构的黄酮类物质的合成和甲基化反应，为工业化大规模发酵生产或酶转化方法生产甲基化黄酮类化合物奠定基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及五条黄酮-8-甲基转移酶、两条黄酮-7-甲基转移酶及其在黄酮如汉黄芩素、异汉黄芩素和苏荠苧黄酮等合成中的应用，还涉及利用这些酶生物合成甲基化黄酮的方法。

背景技术

汉黄芩素(5,7-二羟基-8-甲氧基黄酮)、异汉黄芩素(5,8-二羟基-7-甲氧基黄酮)、苏荠苧黄酮(5-羟基-7,8-二甲氧基黄酮)(三种黄酮的结构如下所示)是传统中草药黄芩和半枝莲的有效成分，对癌症的关键靶点具有较强的抑制作用。8位和7位的甲基化是上述化合物的主要结构特点。在植物天然产物的生物合成过程中，甲基化的过程是通过依赖于S-腺苷-L-甲硫氨酸的甲基转移酶(methyltransferase)催化进行的，这一类酶具有较强的底物和催化部位专一性。

2013年，Anna Berim和David R.Gang在紫花罗勒(Ocimum basilicum L.)中都发现了两种可以催化黄酮8位甲基化的酶，分别为ObF8OMT-1和ObPFOMT-1，两者都可以以pilosin为底物合成石吊兰素，并于2018年实现了二者在酿酒酵母中的功能性表达。黄芩(Scutellaria baicalensis)中的汉黄芩素的合成是由白杨素经过8位羟基化随后进行8位甲基化而来，黄芩中的8位甲基转移酶在2019年得到鉴定。

唇形科植物半枝莲(Scutellaria barbata)中曾经提取出过汉黄芩素、异汉黄芩素、苏荠苧黄酮等甲基化黄酮类化合物，但是目前尚无半枝莲来源的黄酮8位甲基转移酶(F8OMT)和黄酮7位甲基转移酶(F7OMT)的相关报道，因此本领域迫切需要筛选到相应的F8OMT和F7OMT并开发一种生物法合成汉黄芩素、异汉黄芩素和苏荠苧黄酮的方法。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种黄酮-O-甲基转移酶，其包括：具有如SEQ ID NO.1、2、3、4或5所示氨基酸序列的黄酮-8-甲基转移酶，和/或具有如SEQ IDNO.6或7所示氨基酸序列的黄酮-7-甲基转移酶。

本发明还提供编码所述黄酮-O-甲基转移酶的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8、9、10、11、12、13或14所示。其中核苷酸序列SEQ ID NO.8、9、10、11和12分别编码具有如SEQ ID NO.1、2、3、4或5所示氨基酸序列的黄酮-8-甲基转移酶，核苷酸序列SEQ IDNO.13和14分别编码具有如SEQ ID NO.6或7所示氨基酸序列的黄酮-7-甲基转移酶。

本发明还提供一种重组载体，其包含上述编码所述黄酮-O-甲基转移酶的多核苷酸。

根据本发明，所述重组载体包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其他载体。适用于本发明的载体包括但不限于：穿梭质粒载体；在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，如pET-28a等；在酵母中表达的载体，如YEp系列载体等；在哺乳动物细胞中表达的破MSXND表达载体等。只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何载体都可以用于构建重组表达载体。优选质粒载体，如穿梭质粒载体。

本发明还提供一种重组的宿主细胞，其包括一种、两种或更多种所述包含上述编码所述黄酮-O-甲基转移酶的多核苷酸的重组载体。