[发明专利]一种脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化的方法

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、人脐带间充质干细胞培养，釆集人脐血样本，在釆集后6个小时之内进行细胞的分离，将分离后的充质干细胞保存到低温环境中进行收集，并直接用于培养；

步骤二、星形胶质细胞培养，提取星形胶质细胞，在培养箱内培养基上进行培养；

步骤三、hUC-MSCs条件培养基制备，选取一定密度的人脐带间充质干细胞和星形胶质细胞，制成hUC-MSCs条件培养基备用；

步骤四、干预及实验分组，将脐带间充质干细胞和星形胶质细胞按照比例混合，将BV-2细胞接种于条件培养基上，并进行对比试验和人源性造血克隆形成实验，并利用流式细胞仪开展数据检测；

步骤五、MTT比色法检测细胞增殖活力，向BV-2细胞接种的条件培养基内加入MTT进行检测；

步骤六、酶联免疫吸附实验，在BV-2细胞接种于样品组中，进行定时培养，收集处理后各组细胞上清检测细胞因子的含量，开展酶联免疫吸附试验，观察变色情况；

步骤七、免疫印迹检测，收集处理后各组细胞，开展免疫印迹检测；

步骤八、统计学处理，对所获得的实验数据开展实验数据统计分析。

2.据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化的方法，其特征在于：所述步骤一中，脐带间充质干细胞不用带有血清的培养基，而是用干细胞专用培养基，传代也尽量不用胰蛋白酶消化，应该采用专用消化液，能够保证细胞更多的传代次数，且其培养环境为37℃、5% C02.饱和湿度环境。

3.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化的方法，其特征在于：所述步骤四中，人脐带间充质干细胞和星形胶质细胞铺板浓度为1 X10⁶个 /mL，BV-2细胞铺板接种数量为5 X 10⁵，且需要经过时长为24-48小时诱导扩增的混合培养。

4.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化的方法，其特征在于：所述步骤五中，MTT浓度为5mg/ml，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存，在使用时加入到样品组内即可。

5.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化的方法，其特征在于：所述步骤六和步骤七中，酶分子与BV-2细胞（抗体）共价结合，免疫印迹法检测蛋白质特性、表达与分布情况；

其中，免疫印迹法需要用到的试剂：SDS-PAGE试剂；匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml；转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml；0.01M PBS(pH7.4）：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml；膜染色液：考马斯亮兰 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml；包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中；显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H202 1.0μl。