[发明专利]一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒

权利要求书

1.一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒，其特征在于，包括长度多态性遗传标记和质控位点的引物组合物、Taq DNA聚合酶、PCR扩增的缓冲液、对照基因组DNA、纯水；

其中，所述长度多态性遗传标记由位于人基因组5号染色体70.8-71.2Mb范围内的rs146950089、rs76897176、rs59913469、rs36192652、ATA26A05和位于人基因组5号染色体68.0-68.6Mb范围内的rs201750616、rs142599011、rs540996931组成；

所述质控位点为X染色体上的ZFX、Y染色体上的ZFY和15号染色体上的B2M基因；

所述引物组合物包括单条引物含有荧光素标记的如SEQ·ID·No.1～SEQ·ID·No.20所示的引物对；

所述对照基因组DNA为对目标区域的拷贝数已自行验证的、表型正常的人基因组DNA样本。

2.根据权利要求1所述的一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒，其特征在于，所述引物组合物中的引物的终反应浓度为100-300pmol/L。

3.一种非诊断目的的使用如权利要求1-2任意一项所述的一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒来验证拷贝数变异的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，获取待测样本的基因组DNA；

步骤二，按照如下配方配制PCR反应体系，所述反应体系的总体积为20μL：

步骤三，设置PCR扩增程序并扩增：94℃2min；98℃10s，60℃1min，68℃1min，循环次数为26-28次；72℃10min；4℃∞；

步骤四，将步骤三的得到的扩增产物进行毛细管电泳，并对电泳数据进行分析，获得对照样本与各待检样本中相应长度多态性遗传标记的扩增产物峰峰高或峰面积数据；

步骤五，将步骤四测得的峰高通过下式算法计算并验证CNV区域拷贝数：

(1)计算PCR扩增对照基因组DNA中长度多态性遗传标记所有PCR扩增产物峰的峰高和H_c，其中，c指对照样本；

(2)计算PCR扩增对照基因组DNA中长度多态性遗传标记各位点所有PCR扩增产物峰的峰高和h_1c,h_2c,…,h_8c，及其与Hc的比值Rc，记为R_1c，R_2c，…R_8c；

(3)同样的，计算待测样本中的H_s和Rs：h_1s，h_2s,…h_8s；R_1s，R_2s，…R_8s，其中，s指待测样本；

(4)计算RR_i值：RR₁＝R_1s/R_1c；RR₂＝R_2s/R_2c；…；RR₈＝R_8s/R_8c，其中，i＝1,2,…,8；

(5)计算RR₁-RR₈的均值RR₀和标准差SD；

(6)相应地计算目标CNV区域扩增产物峰的RR值，记作RR_v；质控位点ZFX，ZFY和B2M对应的RR值分别记作：RR_x,RR_y,RR_b；

(7)目标CNV区域拷贝数的z检验：

当目标CNV区域无扩增产物峰时，即为0拷贝，不进行z检验；

当目标CNV区域出现相关的扩增产物峰时，通过z检验判断目标区域的拷贝数：

在对质控位点ZFX、ZFY、B2M相应拷贝数进行检验时，分别以相应的RR值RR_x、RR_y、RR_b代替RR_V；其中，m为对照样本中相应目标区域的拷贝数，为已知变量；常数2指8个长度多态性遗传标记所指代的两个单倍型的在人基因组中的拷贝数为2拷贝；

所述目标CNV PCR引物的扩增子长度与所述通用试剂盒中各长度多态性遗传标记扩增子长度不同，且引物对中的1条标记FAM荧光素；所述目标CNV的扩增子的长度范围为80-100bp、170-230bp、235-265bp或360-500bp，T_m值为58-62度。