[发明专利]rhTSG-6荧光定量RT-qPCR检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒在检测rhTSG-6抗病毒活性中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：rhTSG-6蛋白标准品、含有VSV N基因片段的重组质粒标准品；RT-PCR反应液；

所述VSV N基因片段为使用上游引物和下游引物，利用RT-PCR方法从VSV病毒扩增制备得到；所述上游引物为： 5’-CGG AAT AAA CAT CGG GAA AG-3’；所述下游引物为：5’-CCAAGT AGA TAC AAA GGC AAC C-3’；

所述RT-PCR反应液为：SYBR Premix Ex TaqⅡ 2× 10μL、10μM上游引物0.8μL、10μM下游引物0.8μL、cDNA模板2μL，补无菌水至20μL；

所述cDNA的制备方法为：以100ng/mL 的rhTSG-6蛋白标准品溶液作用MDBK细胞24h，再用VSV病毒悬液感染作用后的MDBK细胞24h，提取这些感染细胞的总RNA，再经逆转录后得到cDNA；所述rhTSG-6蛋白标准品溶液的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述应用为非疾病诊断、和/或非治疗目的的应用。

2.根据权利要求1所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒在检测rhTSG-6抗病毒活性中的应用，其特征在于，所述VSV病毒的病毒悬液的滴度为100TCID₅₀/0.1mL；VSV病毒感染作用后的MDBK细胞的时间为24h。

3.根据权利要求1或2所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒在检测rhTSG-6抗病毒活性中的应用，其特征在于，所述含有VSV N基因片段的重组质粒标准品的制备方法包括以下步骤：

（1）使用上游引物和下游引物，利用RT-PCR方法从VSV病毒扩增出VSV N基因片段；所述上游引物为： 5’-CGG AAT AAA CAT CGG GAA AG-3’；所述下游引物为：5’-CCA AGT AGATAC AAA GGC AAC C-3’；

（2）将VSV N基因片段连接至pMD18T载体上，构建的重组质粒pMD18T-VSV N；

（3）将重组质粒pMD18T-VSV N转化至大肠埃希菌DH5α，在含100μg/mL Amp的LB培养基中增殖，裂解法提取，经试剂盒纯化，即可得到含有VSV N基因片段的重组质粒标准品。

4.根据权利要求3所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒在检测rhTSG-6抗病毒活性中的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述RT-PCR反应体系为RT-PCR反应体系为：Premix Taq 2× 12.5μL、10μM上游引物0.5μL、10μM下游引物0.5μL、cDNA模板1μL，补无菌水至25μL。

5.根据权利要求3所述的重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的荧光定量RT-qPCR检测试剂盒在检测rhTSG-6抗病毒活性中的应用，其特征在于，步骤（2）中，连接反应体系为：pMD18-T Vector 1μL、VSV N基因片段2μL、5μLSolutionⅠ灭菌水2μL，反应条件为16℃反应2h。