[发明专利]一种干细胞复合外泌体的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种干细胞复合外泌体的制备方法，具体为脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、脐带间充质干细胞外泌体的制备：

1)从细胞库中选取P3-P6的脐带间充质干细胞复苏，进行饥饿培养；

2)收取细胞培养上清液，离心处理后，进行过滤，加入聚乙二醇进行孵育；

3)孵育后，离心处理，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入聚乙二醇，进行再次孵育，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得脐带间充质干细胞外泌体；

S2、宫内膜干细胞外泌体的制备：

1)从细胞库中选取人源P3-P6的子宫内膜干细胞复苏，进行饥饿培养；

2)回收全部培养上清液，进行过滤，离心处理后，收集离心上清液；对收集的离心上清液进行二次离心处理；

3)离心后，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入聚乙二醇，再次孵育，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得宫内膜干细胞外泌体；

S3、脐带间充质干细胞与宫内膜干细胞复合外泌体的制备：

将脐带间充质干细胞外泌体和宫内膜干细胞外泌体混合，得到复合干细胞外泌体浓缩液，向复合干细胞外泌体浓缩液中加入保护剂，低温冷冻干燥处理，得到干细胞外泌体冻干粉，即为脐带间充质干细胞与子宫内膜干细胞外泌体复合生长因子。

2.根据权利要求1所述的一种干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中脐带间充质干细胞外泌体的具体制备方法为：

1)从细胞库中选取P3-P6的脐带间充质干细胞复苏，将细胞以2×10⁵/cm²的密度接种至无血清的DMEM培养基中；细胞接种完成，放于CO₂培养箱内，温度37℃，CO₂体积比浓度5％，在饱和湿度下培养；培养16-24h后，以生理盐水清洗细胞2次，去除未贴壁细胞，用复方电解质溶液进行饥饿培养12-24h；

2)收取细胞培养上清液，将上清液在3500-5000g的离心力条件下离心处理6-8min，除去沉淀，取离心后上清液备用；用0.22μm孔径的无菌滤膜过滤上清液，加入终浓度为10％的聚乙二醇，混匀，4℃孵育10-16h；

3)孵育后，离心处理，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入终浓度为8％的聚乙二醇，再次孵育30min，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得脐带间充质干细胞外泌体，分装成3-5ml/支，-80℃保存。

3.根据权利要求1所述的一种干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中宫内膜干细胞外泌体的具体制备方法为：

1)从细胞库中选取人源P3-P6的子宫内膜干细胞复苏，复苏后细胞生长状态良好，微生物检测必须为阴性，按照6×10⁴/cm²的初始密度将细胞接种于无血清的细胞工厂培养体系中；细胞接种完成，放于CO₂培养箱内，CO₂体积比浓度5％，温度37℃，在饱和湿度下培养；接种培养16-24h后，细胞融合率达到80-90％左右，细胞生长状态良好，吸弃培养上清液，用生理盐水清洗细胞2-3次，然后，加入复方电解质溶液，放入CO₂培养箱中饥饿培养24-30h；

2)回收全部培养上清液，以0.22um孔径的滤膜过滤，过滤后的培养上清液在3500-5000g的离心力条件下离心处理10-15min，收集离心上清液；在20000-50000g的离心力条件下对收集的离心上清液继续离心处理20-40min；

3)离心后轻轻取出离心管，弃去上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，加入终浓度为8％的聚乙二醇，再次孵育30min，离心处理后，用PBS缓冲液重悬沉淀，经蛋白含量测定、质量安全评价，即得宫内膜干细胞外泌体，分装成3-5ml/支，-80℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中脐带间充质干细胞外泌体制剂中外泌体浓度以蛋白浓度计为0.4-0.7mg/ml。