[发明专利]一种热稳定性酸性乳糖酶及基因与菌株和应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种热稳定性酸性乳糖酶及基因与菌株和应用。本发明的乳糖酶AoGAL的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的乳糖酶AoGAL在原有乳糖酶的基础上通过人工定向改造而来，具有显著提高的温度稳定性和对高温的耐受性。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种热稳定性酸性乳糖酶及编码基因、重组表达载体、重组表达菌株，以及它们的制备方法和应用。

背景技术

乳糖酶(E.C.3.2.1.23)可特异性地水解乳糖和其它低聚糖和二糖中的β(1-4)半乳糖苷键的水解。在食品领域，乳糖酶主要用来使乳糖水解为葡萄糖和半乳糖。对于内源性乳糖酶功能弱的人群和乳糖不耐受的婴幼儿和成人等人群，在乳品中添加乳糖酶或者口服乳糖酶可以有效地消除乳糖的影响。另一方面，在乳品工业，乳糖酶可使低甜度和低溶解度的乳糖转变为较甜的、溶解度较大的单糖；使冰淇淋、浓缩乳、淡炼乳中乳糖结晶析出的可能性降低，同时增加甜度。随着人们生活水平的日益提高，对牛奶及各种乳制品的需求也逐步增高，但是随之也产生了乳糖不耐受的问题，而消化补充外源性乳糖酶则是缓解乳糖不耐受症状的重要解决办法。在另一领域，乳糖酶能催化β-D-半乳糖苷和α-L-阿拉伯糖苷水解。因此，在饲料中添加乳糖酶，不仅可以水解乳糖，解决乳猪的乳糖不耐受性，同进可以降饲料中的抗营养因子，提高饲料的营养效价。

乳糖酶主要来源于细菌、霉菌、酵母等微生物。通常，来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的乳糖酶的最适pH为7.0～7.5之间；来源酵母菌如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的最适pH为6.0～7.0之间；来源于霉菌如黑曲霉(Aspergillusniger)的乳糖酶呈现为酸性偏好性，其最适pH在5.0左右。不同来源的乳糖酶由于其最适pH不同，因而各自的用途不同。来源于黑曲霉的乳糖酶由于其酸性的特性，在乳制品加工如在乳清的加工中去除乳糖、作为口服剂，或在饲料中添加消除乳猪对乳糖不耐受性以及消除其它抗营养因子等领域具有广泛的用途。

乳糖酶的最适温度范围为37～50℃。但是为了扩大乳糖酶的应用领域，特别是在食品、饲料、动物营养等包含高温加工工艺的领域的应用，乳糖酶的热稳定性和高温耐受性需要进一步加强。

乳糖酶的高产菌株是实现乳糖酶的工业应用的前提。目前适用于热稳定性好、酸性的乳糖酶较缺乏。传统的乳糖酶因其表达量低而使得催化效率不高，经济性不好，且热稳定性和耐温性较差、要求反应条件苛刻，并不适用大规模的在高温、酸性环境中应用。

毕赤酵母真核表达系统是目前广泛使用的真核生物表达系统，它具高密度发酵工艺成熟、生产技术配套等优点，是乳糖酶工业化生产的理想菌株。然而，由于受到毕赤酵母对异源基因密码子使用偏好性等因素的影响，来源于曲霉的乳糖酶往往不会高效表达。因此，对异源基因的密码子依据毕赤酵母的偏好性进行优化是提高其产量的有效途径。

因此，需要对乳糖酶进行改造来提高酶对温度的稳定性，通过密码子优化等手段提高乳糖酶的表达水平，降低生产和使用成本。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种热稳定性的酸性乳糖酶及基因、重组表达载体、重组表达菌株、乳糖酶制备方法，旨在提高为乳糖酶的产业化及应用奠定基础。

为了实现上述目的，本发明提供一种热稳定性酸性乳糖酶AoGAL，所述乳糖酶AoGAL的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的乳糖酶AoGAL的适宜温度为60℃，最适pH为5.5。

本发明第二方面提供一种乳糖酶基因aogal，用于编码所述的乳糖酶AoGAL，具体地，所述乳糖酶基因aogal的碱基序列与SEQ ID NO：2所示的碱基序列具有95％以上的同一性。优选地，所述乳糖酶基因aogal含有SEQ ID NO：2所示的碱基序列即可实现本发明的效果。最优选地，所述乳糖酶基因aogal的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。