[发明专利]一种小牛皱胃凝乳酶及基因与菌株和应用

权利要求书

1.一种小牛皱胃凝乳酶BoCHY，其特征在于，所述凝乳酶BoCHY的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.一种凝乳酶基因bochy，用于编码权利要求1所述的凝乳酶，其特征在于，所述凝乳酶基因bochy的碱基序列与SEQ ID NO：2所示的碱基序列具有95％以上的同一性。

3.根据权利要求2所述的凝乳酶基因bochy，其特征在于，所述凝乳酶基因bochy的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

4.权利要求3所述的凝乳酶基因bochy的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：通过定点突变的方法将原始凝乳酶第201位的丝氨酸突变为天冬酰胺，第267位的甲硫氨酸突变为赖氨酸，第271位的苏氨酸突变为脯氨酸；所述原始凝乳酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

5.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的凝乳酶基因bochy。

6.权利要求5所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

在权利要求2或3所述的凝乳酶基因bochy两端分别加上酶切位点EcoR I和Not I酶切位点，然后分别用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切，得到具有粘性末端的凝乳酶基因bochy片段；

将毕赤酵母表达载体pPICZαA分别用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切，得到具有粘性末端的载体pPICZαA片段；

将所述具有粘性末端的凝乳酶基因bochy片段和所述具有粘性末端的载体pPICZαA片段通过T4 DNA连接酶连接，获得凝乳酶重组表达载体pPIC-bochy。

7.一种重组表达菌株，其特征在于，包括如权利要求5所述的重组表达载体。

8.根据权利要求7所述的重组表达菌株，其中，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。

9.权利要求7或8所述的重组表达菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将凝乳酶重组表达载体pPIC-bochy通过酶切位点将其线性化；

将线性化的重组表达载体pPIC-bochy导入宿主细胞中，获得重组表达菌株。

10.权利要求1所述的小牛皱胃凝乳酶BoCHY的生产方法，其特征在于，培养权利要求7或8所述的重组表达菌株，从培养物中获得凝乳酶。

11.权利要求1所述的小牛皱胃凝乳酶BoCHY的应用，其特征在于，将权利要求1所述的小牛皱胃凝乳酶BoCHY与含乳物料接触。