[发明专利]一种从细胞裂解液中直接快速制备交联酶聚集体的方法

说明书

本发明涉及一种从细胞裂解液中直接快速制备交联酶聚集体的方法，包括下述步骤：首先将双炔交联剂溶解在异丙醇中，然后将双炔交联剂分散于掺入不同数量非天然氨基酸的醛酮还原酶突变体的细胞破碎液上清中；将装有上述混合物的容器放入配有冷却模块的微波反应器中进行反应，利用双炔交联剂与非天然氨基酸侧链反应基团间的特征反应，制得交联酶聚集体并实现目标酶蛋白的纯化。本发明通过改变突变位点的数目，获得了在不同位点掺入非天然氨基酸的突变酶，实现了精准和可控的多点交联，可有效保护酶蛋白的活性中心以及酶催化活性。本发明无需使用金属离子、有机溶剂等，安全可靠且绿色环保，很大程度节约了纯化所耗的时间和成本，适合工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种酶聚集体的制备方法，尤其是涉及一种从细胞裂解液中直接快速制备交联酶聚集体的方法。

背景技术

催化剂酶是从容易获得的可再生资源中产生的，并且是可生物降解的。酶介导的生物催化反应具有很高的催化效率，化学选择性，区域选择性和立体选择性，在发酵，化学，食品工业和环境管理中具有广泛的应用。但是，此类实际应用受到游离酶的实际的一些缺点，例如，热稳定性低，最适pH范围，对大多数有机溶剂和许多金属离子的耐受性低等。此外，酶导致了不可避免的纯化和分离步骤。固定化酶提供了一种可重复性，并提高了酶的稳定性，例如提高了对有机溶剂的耐受性，pH耐受性和热稳定性。

大多数固定化酶依赖特定的支持物。然而，由于引入了大多数非催化物质，额外的固定化酶载体导致固定化酶活性的稀释。为了克服这些缺点，自发展以来，在无载体情况下的固定化酶的技术引起了人们的极大兴趣，这将降低酶反应中的时空产率，比活性等。其中最典型的是交联酶聚集体。交联酶聚集体最早描述于20年代初期，将游离酶酶溶解在水溶性溶剂中并以物理聚集体的交联而产生的。交联酶聚集体通常在有机溶剂中是稳定的，与未固定的酶相比，酶的活性没有改变，在某些情况下有所增强。交联酶聚集体对有机溶剂，极高的pH值和高温表现出很高的抵抗性。

传统酶聚集体的制备主要依赖于戊二醛法，因为它便宜且容易大量购得，所以通常是我们选择的交联剂。它已经被用于交联蛋白质数十余年，戊二醛法的缺陷在于其与侧链氨基的反应(席夫碱反应)随机进行，以及由此引起酶蛋白的活性中心被掩埋或破坏，以致酶催化活力大大降低，通常酶蛋白交联后最终比活力仅为初始的10～20％。

另外，固定化酶中最麻烦的问题之一是需要使用纯酶，而酶的纯化是个冗长且复杂的过程。通常纯化的蛋白质被广泛用于固定在固体支持物上，但是蛋白质的纯化通常使用较多的其他辅助耗材和试剂，成本高，周期长，酶活损失较为严重。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明提供了一种从细胞裂解液中直接快速制备交联酶聚集体的方法，即一种微波辅助的非天然氨基酸掺入酶的形成酶聚集体的方法。为了实现酶的精确和可控制的固定，非天然氨基酸用于插入酶蛋白中以进行靶向共价固定，而微波辅助辐射用于完成酶聚集体的制备；通过改变突变位点的数目，获得了在不同位点掺入非天然氨基酸的突变酶，从而实现了准确和可控的多点固定。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种从细胞裂解液中直接快速制备交联酶聚集体的方法，包括下述步骤：首先将双炔交联剂溶解在异丙醇中，然后将双炔交联剂分散于掺入不同数量非天然氨基酸的醛酮还原酶突变体的细胞破碎液上清的磷酸盐缓冲液(磷酸钾缓冲液，KBS)中；设定叠氮化物与炔基的反应摩尔比；将装有上述混合物的容器放入配有冷却模块的微波反应器中进行反应后分离固定的酶，利用双炔交联剂与非天然氨基酸侧链反应基团间的特征反应，制得交联酶聚集体并实现目标酶蛋白的纯化。其中通过控制微波反应系统和冷却模块之间的温差来诱导连续照明。

作为优选，所述双炔交联剂为5,6,11,12-四氢二苯并[a,e]环辛烯。

作为优选，所述醛酮还原酶包括三点突变的醛酮还原酶和五点突变的醛酮还原酶。醛酮还原酶的突变位点的选择要使突变位点远离蛋白活性中心和活性位点并突变为TAG密码子，并于单点的基础上进行三点和五点的目的基因突变。