[发明专利]基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法及其应用

权利要求书

1.一种基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，其特征在于，通过基因工程构建两种工程菌，使SUMO标签N端与一种菌的膜锚定蛋白融合，而SUMO标签C端与目的蛋白融合，同时将Ulp1蛋白酶融合到另外一种菌的膜锚定蛋白上，再将两种所述工程菌诱导表达后离心，重悬到缓冲液并混合孵育，离心后上清中即可得到目的蛋白；

具体包括以下步骤：

步骤1：合成表达大肠杆菌前脂蛋白信号肽Lpp第1-9位氨基酸、跨膜蛋白OmpA第46-159位氨基酸、SUMO标签序列中100个氨基酸的融合蛋白序列的编码基因lpp-ompA-sumo，并将所述lpp-ompA-sumo克隆到pET-28b线性载体，连接产物转入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到SUMO融合蛋白膜表面表达载体pET-LO-SUMO；

步骤2：合成表达大肠杆菌自转运蛋白YfaL的第1-28位氨基酸、酿酒酵母Ulp1蛋白酶的第327-545位氨基酸和YfaL的第786-1250位氨基酸的融合蛋白序列的编码基因yfal-ulp1，并将所述yfal-ulp1克隆到pET-28b线性载体，连接产物转入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到Ulp1融合蛋白膜表面表达载体pET-YfaL-Ulp1；

步骤3：合成表达目的蛋白M的编码基因m，并将所述编码基因m克隆到pET-LO-SUMO线性载体，连接产物转入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到SUMO融合M蛋白膜表面表达载体pET-LO-SUMO-M；

步骤4：将所述pET-LO-SUMO-M、pET-YfaL-Ulp1分别转入BL21感受态细胞，获得pET-LO-SUMO-M/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株；

步骤5：将pET-LO-SUMO-M/BL21菌株和pET-YfaL-Ulp1/BL21菌株分别诱导培养，离心后重悬到缓冲液，再混合孵育，离心收集上清，获得目的蛋白M。

2.如权利要求1所述的基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，其特征在于，步骤1中扩增引物为：

Lpp-1：

CTTTAAGAAGGAGATATACCATGAAGGCGACCAAACTGGTGCTGG

SUMO-2：

GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCATATGACCTCCAATCTGTTCGCGGTGAGC

扩增条件为：95℃预变性5min，95℃40s、50℃40s、72℃3min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，其特征在于，步骤2中扩增引物为：

YfaL-Ulp1-1：

CTTTAAGAAGGAGATATACCATGCGTATCATTTTCCTGCGTAAGGAGYfaL-Ulp1-2：

TGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTACCATTTCACGGTCATGCTCAGAAAAC

扩增条件为：95℃预变性5min，95℃40s、50℃40s、72℃4min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

4.如权利要求1所述的基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，其特征在于，步骤1所述的pET-28b线性载体是经NcoI和XhoI双酶切得到的，步骤2中所述的pET-28b线性载体是经NcoI和HindIII双酶切得到的，步骤3中所述的pET-LO-SUMO线性载体是经NdeI双酶切得到的。

5.如权利要求1所述的基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，其特征在于，步骤3中所述目的蛋白M为红色荧光蛋白mCherry，所述红色荧光蛋白mCherry的编码基因为mcherry。