[发明专利]SARS-CoV-2的重组N蛋白及其制备与纯化方法

说明书

本发明涉及蛋白纯化技术领域，具体而言，涉及一种SARS‑CoV‑2的重组N蛋白及其制备与纯化方法。该SARS‑CoV‑2的重组N蛋白具有N蛋白序列，且所述N蛋白序列的两端分别与寡聚精氨酸片段相连；其表达方法包括：a.提供包含重组N蛋白的样品；以及b.经至少一次阳离子交换层析树脂纯化处理，收集穿透物。该方法可以有效提高重组N蛋白的表达纯度。根据本发明纯化得到的重组N蛋白的纯度最高可以达到约95%以上。

技术领域

本发明涉及蛋白纯化技术领域，具体而言，涉及一种SARS-CoV-2的重组N蛋白及其制备与纯化方法。

背景技术

严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型（Severe Acute Respiratory SyndromeCoronavirus 2，SARS-CoV-2）是冠状病毒科乙型冠状病毒属严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒种的一个分型，具有包膜的正链单股RNA，它造成了于2019年底爆发的2019冠状病毒病（COVID-19）。它的基因序列和非典病毒及中东呼吸综合征病毒属于同一谱系但不同进化枝。中华人民共和国国家卫生健康委员会将此病毒感染引起的急性呼吸道疾病定为法定乙类传染病，按甲类管理。

N蛋白是冠状病毒的一种主要结构蛋白，其是一种碱性蛋白，以往对动物冠状病毒结构蛋白的研究表明，N蛋白在病毒复制和产生的病理反应中起重要作用。N蛋白的苏素化在同源性低聚物的形成中起着很大的促进作用，并且N蛋白对宿主细胞裂解的调节方面也起重要作用。

现有技术中对COVID-19的确诊主要是采用核酸检测试剂盒进行。核酸检测法通过反转录酶将RNA反转录为DNA，再在DNA聚合酶的作用下PCR扩增使信号增强，从而显示出病毒核酸的存在。但是，新冠病毒属于RNA病毒，在样本采集、保存及运输过程中，RNA分子极易降解，造成核酸检测的假阴性结果。核酸检测一个反应耗时大约2小时，需要荧光定量PCR仪，耗时长且设备要求高。

在病毒感染的过程中，人体会应激产生相对应的抗体来抵抗感染，因此通过检测抗体是否存在来判断是否感染病毒的免疫诊断法，可以作为核酸检测法的一个很好补充。人体产生的抗体在血液中能稳定存在，特异性高，检测速度快。N蛋白作为冠状病毒主要结构蛋白，会刺激机体产生大量特异性抗体，但现有技术中还未有针对SARS-CoV-2的N蛋白的特异性、高收率的纯化方法，因而如果将现有技术制备的重组N蛋白用于COVID-19相关抗体的检测往往准确度不高，会对检测结果造成干扰。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及SARS-CoV-2的重组N蛋白，其具有SEQ ID NO：1所示的N蛋白序列，且所述N蛋白序列的两端分别与寡聚精氨酸片段相连。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及一种SARS-CoV-2的N蛋白的纯化方法，包括：

a. 提供包含如上所述的重组N蛋白的样品；以及

b. 经至少一次阳离子交换层析树脂纯化处理，收集穿透物。

SEQ ID NO：1所示的N蛋白序列为SARS-CoV-2保守序列，有利于提高检出率以及检测灵敏度和特异性。其两端与寡聚精氨酸片段相连具有多方面的作用，一方面寡聚精氨酸片段不具有免疫原性，从而可有效降低背景噪音，避免出现假阳性的问题；另一方面，N蛋白本身的理论等电点达到10.51，在两端添加寡聚精氨酸片段，使理论等电点更偏向于碱性（10.93），在应用阳离子交换层析纯化过程中，使目的蛋白更有效的结合在阳离子交换柱上。同时在蛋白制备时，例如在菌体匀浆时通常添加少量RNase，可以有效快速降解结合在目的蛋白上的RNA分子，又因为高等电点，在盐浓度线性洗脱过程中，NP蛋白与其他大部分杂蛋白可有效分离开。以上诸多因素可以有效提高重组N蛋白的表达纯度。根据本发明纯化得到的重组N蛋白的纯度最高可以达到约95%以上。

本发明还提供该重组N蛋白涉及的核酸、载体、宿主细胞及制备方法。