[发明专利]一种比活提高的溶菌酶突变体

说明书

本发明公开了一种比活提高的溶菌酶突变体，属于生物工程技术领域。本发明公开了一种利用基因工程在人源溶菌酶C末端添加疏水短肽Val‑Ile‑Pro‑Leu‑Phe而得到的人源溶菌酶突变体，其比活提高了126％。本发明还公开了一种含突变人源溶菌酶基因的重组质粒，以及经过该重组质粒转化毕赤酵母后获得的高效表达人源溶菌酶突变体的重组毕赤酵母基因工程菌。本发明获得的人源溶菌酶突变体具有比活高，制备简单的特点，具有潜在的临床应用价值，在饲料、食品工业上也具有广泛的用途。

技术领域

本发明涉及一种比活提高的溶菌酶突变体，属于生物工程技术领域。

背景技术

溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，能够水解细菌细胞壁中β-1，4糖苷键，破坏细胞壁肽聚糖的结构，从而保护宿主细胞免受细菌感染。人源溶菌酶属于c型溶菌酶，由130个氨基酸组成，相对分子量为14700。人源溶菌酶还具有抗病毒、增强免疫力和抗肿瘤的功效。溶菌酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，对人及动物无毒害作用，也不会在体内残留，是一种安全性很高的药品、饲料和食品添加剂。在畜牧业溶菌酶可用作饲料防腐剂和杀菌剂。在食品行业，溶菌酶可作为抗菌防腐剂添加到食品中，且对人体无任何毒副作用，也可利用其具有一定甜味的特点，作为低卡路里的食品甜味剂。

目前，市场上销售的溶菌酶主要是从鸡蛋清、动物脏器等中提取获得的，这种溶菌酶热稳定性差，活力只有人源溶菌酶活力的一半。但人源溶菌酶受限于原料来源、纯化精制成本等因素，制备量较少，无法满足各领域的需求。因此，提供一种低成本的高产溶菌酶的方法，具有广阔的应用前景。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过基因工程技术在人源溶菌酶的C末端添加疏水短肽Val-Leu-Phe、Val-Ile-Pro-Leu-Phe或Val-Ile-Pro-Leu-Phe，显著提高人源溶菌酶的比活，有效提升人源溶菌酶的杀菌效果。

本发明的第一个目的是提供一种比活提高的人源溶菌酶，所述人源溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码上述人源溶菌酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所示。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述基因的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体是pPIC9K。

本发明的第四个目的是提供一种表达上述人源溶菌酶的基因工程菌。

本发明的第五个目的是提供一种提高人源溶菌酶比活的方法，是在氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的人源溶菌酶的C末端添加疏水短肽Val-Leu-Phe、Val-Ile-Pro-Leu-Phe或Val-Ile-Pro-Ala-Ala-Ile-Pro。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以毕赤酵母细胞为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以毕赤酵母KM71或者GS115为宿主。

本发明还提供了上述人源溶菌酶在制备饲料添加剂、食品防腐方面的应用。

本发明还提供了上述人源溶菌酶在食品或饲料领域的应用。

与现有的技术相比，本发明的优点和积极效果是：

本发明利用毕赤酵母表达系统来作为生产人源溶菌酶的表达系统，具有生产成本低、操作简单、生长迅速、表达效率高、发酵与分泌性能良好等优点，本发明优化后的编码人源溶菌酶m5HLM(氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)的基因经毕赤酵母表达系统产生的人源溶菌酶比活为21043U/g，较野生型提高了约126％。