[发明专利]一种表达链球菌溶血素成熟蛋白的工程菌及其应用

说明书

本发明涉及一种表达链球菌溶血素成熟蛋白的工程菌及其应用，属于生物医学工程领域和微生物工程领域。本发明在基于大肠杆菌胞内表达系统，对链球菌溶血素成熟蛋白全序列的核酸序列进行优化设计，在链球菌溶血素蛋白的两端分别融合GSSSSHHHHHHHHSS(GSHS)和SSHHHHHHSS(SHS)多肽片段后，表达蛋白的活性产量达到5×10⁷HU/mL，蛋白产量达到4mg/mL，胞内占比可达40％。该质粒及工程菌具有实现链球菌溶血素成熟蛋白全序列表达，活性蛋白表达量高、蛋白稳定性好、蛋白抗原性正常(在非变性状态下，抗原性正常)、对宿主生长影响小等五个方面的综合优势。

技术领域

本发明涉及一种表达链球菌溶血素成熟蛋白的工程菌及其应用，属于生物医学工程领域和微生物工程领域。

背景技术

链球菌溶血素蛋白是链球菌感染过程中的重要致病因子，能引起人和动物细胞膜产生穿孔，具有抗原性，能刺激人体产生抗体，抗体过量产生会导致关节等部位异常。

在链球菌感染检测中，链球菌溶血素蛋白标品是一种重要试剂，在市场和临床中具有广泛的需求，在国内外制备的链球菌溶血素蛋白免疫试剂盒中，链球菌溶血素蛋白标品是链球菌溶血素蛋白免疫试剂盒的重要组分，目前国际上制备链球菌溶血素蛋白的产率较低。

目前，链球菌溶血素蛋白来源一是通过天然链球菌提取，但产量较低；二是通过大肠杆菌重组表达。链球菌溶血素全长成熟蛋白不与有关标签融合表达的研究显示，表达蛋白稳定性好，在蛋白变性和非变性状态下均显示抗原性，但蛋白表达量低，为0.3mg/mL。之后，由于研究人员发现天然链球菌溶血素全蛋白的前77个氨基酸组成的肽段部分对大肠杆菌毒性较大，可能有抑制表达的效果，因而采取了表达其第77号氨基酸后续多肽片段的策略，总体蛋白表达量最大可达到3mg/mL，缺点是表达蛋白的比活相对较低，非活性蛋白较多，溶血活性产量为2.4×10⁶HU/mL，说明表达的胞内蛋白有效折叠差，而且该表达的上清蛋白样品在-20和-80℃低温下直接保存的稳定性差，容易变性。为了进一步提高SLO的活性蛋白表达产量，前人用一种果胶酸裂解酶作为融合标签与77号氨基酸后续片段共同表达，表达产量达到4mg/mL，将酶活产量提高达4×10⁷HU/mL，蛋白的产量胞内占比可达38％，但由于较大融合标签带来的的空间位阻作用，导致蛋白在非变性状态下，抗原决定基团暴露受影响，抗原性受到屏蔽。

因此，目前还是缺少同时具备高活性蛋白表达、蛋白产品稳定性好和抗原性正常等条件的SLO表达工程菌。另外，在链球菌引起的疾病中，病原体释放的SLO必然是含全序列氨基酸的溶血素成熟蛋白，所以为医学临床SLO抗体检测提供的SLO蛋白还是含全序列氨基酸比较合理，所以优化全序列氨基酸的溶血素成熟蛋白的技术在临床上的价值高于优化77氨基酸后的溶血素蛋白片段，本专利提供满足表达链球菌溶素的全序列成熟蛋白、具备高活性蛋白表达、蛋白产品稳定性好和抗原性正常等条件的SLO表达工程菌，更合理和临床应用意义更大。

发明内容

本发明针对缺乏能够高效表达稳定性和抗原性俱佳的链球菌溶血素成熟蛋白全序列的质粒和工程菌，难以综合解决链球菌溶血素蛋白重组表达在成熟全序列表达、对宿主生长有影响、表达量低、稳定性低和抗原性缺失等方面的多种问题，提供了一种溶血素融合蛋白 GSHS-SLO-SHS及其表达质粒与应用。

本发明提供了一种能够在大肠杆菌中高效表达的、蛋白稳定性与抗原性俱佳的链球菌溶血素蛋白，具有稳定性与抗原性俱佳，含GSSSSHHHHHHHHSS(GSHS)和SSHHHHHHSS(SHS) 的双Tag，含有链球菌溶血素成熟蛋白氨基酸全序列，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了编码链球菌溶血素蛋白的基因GSHS-SLO-SHS，所述基因核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种表达所述链球菌溶血素蛋白或含有所述编码链球菌溶血素蛋白基因的表达载体。